野木瓜总皂苷的分离纯化及抗氧化活性研究
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摘要
野木瓜(Starntonia Chinensis)属蔷薇科(Rosaceae)木瓜属(Chaenomeles)植物，是贵州省正安县的特色资源。野木瓜含多种有机酸、氨基酸、蛋白质、维生素和矿物质等元素，并富含三萜皂苷、多糖、黄酮、SOD等活性物质，是一种药食两用的天然植物，在临床治疗及保健功能上均具有广泛的应用价值。目前对野木瓜的研究主要集中在普通保健食品的开发上，有效成分提取纯化和活性方面的系统研究尚未见报道。本论文通过对野木瓜三萜皂苷进行分离纯化的工艺研究及体外抗氧化活性的试验，建立了野木瓜总皂苷的含量测定方法，提出了适宜于野木瓜总皂苷提取及纯化的最佳工艺条件，并对其体外抗氧化活性作了初步的探索。主要研究内容和结果如下：
1．野木瓜总皂苷的含量测定
选用齐墩果酸为标准品，采用分光光度法，以5％冰乙酸-香草醛溶液和高氯酸为显色剂，在545 nm处测定吸光度。以齐墩果酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线，经计算得回归方程Y=0.04667 X+0.08025(r=0.9994)，方程在4～28μg／mL范围内线性关系良好，以此计算野木瓜中总皂苷的含量。经方法学实验结果显示，在1h内吸收值稳定，RSD为0.78％；精密度和重现性良好，RSD分别0.66％和1.41％；平均回收率为102.21％(n=5)，RSD为2.23％。表明本法简便灵敏，重现性良好，方法可靠，可作为野木瓜总皂苷的定量方法。
2．野木瓜总皂苷浸提条件的优化
以乙醇为提取溶剂，采用浸提法来考察影响野木瓜总皂苷提取率的因素。在单因素实验的基础上，用正交实验确定了最佳的提取条件。结果表明，以75％乙醇为提取溶剂，料液比1∶15，提取温度为70℃，时间为60 min，pH值为7时总皂苷的提取率最高。
3．野木瓜总皂苷纯化工艺的优化
采用D_(101)大孔树脂柱(R15×H200 mm，干树脂质量4.000 g)分离纯化野木瓜总皂苷，最佳的吸附参数是：上样液浓度8.86 mg／mL，流速1 mL／min，pH5左右，最大进样体积不超过18 mL。最佳的洗脱条件是：先用100 mL蒸馏水洗去杂质，再用100 mL 50％乙醇洗脱野木瓜总皂苷，洗脱流速1.5 mL／min，收集50％乙醇洗脱部分。研究结果表明，未纯化前总固物中总皂苷的含量为33.5％，纯化后总固物中的野木瓜总皂苷含量为60.3％，精制度达179.2％，且洗脱率达80％以上。从精制度、纯化率等方面考虑，该工艺适宜于野木瓜总皂苷的分离及纯化。
4．野木瓜总皂苷抗氧化活性的初步研究
体外抗氧化活性实验表明，野木瓜总皂苷具有清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力。且清除能力与样液浓度呈量效关系，其中对羟基自由基的能力较强，而对超氧阴离子的清除能力不及同浓度的V_c能力强。
Yemugua, a specialized resource of ZhengAn county in GuiZhou province, belongs to Rosaceae Chaenomelses plant. It implies various organic acids, amino acids, minerals, vitamins, traceelements, and contains some active substances such as trierpenoid saponins, flavoxate , polysaccharides, SOD, and so on.Being a natural plant used as both medicines and foods, it has been applied widely on clinical treat and health protection. At present, the research aimed to Yemugua is concentrated mainly on exploitation of common food , and systematic research on extraction and purification for its active substance remains unreported. The article studied majorly technology conditions of extracting and purifying total saponins, established content determination method of total saponins for Yemugua,posed the best technology parameters suitable to extract and purify for total saponins. In addition, studied initially and tried on its antioxidant capability outside body.The research work and experiment results are as follows:
1. Content determination method of total saponins for Yemugua
By selecting oleanolic acid as control article, colorating with 5% vanillin-CH_3COOH and HClO_4, determined absorbability in the point of 545nm with ultraviolet-visible absorption spectroscopy and calculated total saponin content of Yemugua. The results showed that the method is linear in the range of 20～140μg(r=0.9994), absorbability stability within 1h, RSD 0.78%, moreover, the average recovery 102.21%, RSD 2.23%(n=5). The conclusion is that the method is sensitive and reliable, which may be used for the quality control of Yemugua.
2. The optimization of extraction conditions for total saponins of Yemugua
Influence factors about extraction ratio of total saponins had been studied by selecting alcohol as solvent and taking method of immersion to withdraw. On the basis of single factor experiment, used orthogonal design to confirm the best extraction parameters. As a result, when alcohol level 75%, solid-liquid proportionl:15,temperature and time respectively 70℃and 60min, the extraction ratio can reach to the highest level.
3. The optimization of purification process for total saponins of Yemugua
To use D_(101) macroporous resin (column specification:R15×H200 mm , resin weight :4.000 g) for purifying total saponins of Yemugua, the optimal adsorption conditions were concentration of feed 8.86mg/mL, feeding rate 1 mL/min, PH value 5, the limited feed volume 18mL. The optimal de-adsorption parameters were alcohol concentration 50 %, elution volume both of water and alcohol were 100 mL, elution rate 1.5 mL/min,then the part eluted by 50 %alcohol were gathered. The experimental results showed that total saponins of Yemugua in the solid extract could reach 60.3 %, well above unpurified of 33.5 %, the refine ratio and elution ratio reached respectively 179.2 % and above 80 %.On the whole, the optimal conditions are suitable for separation and purification of total saponins in Yemugua.
4. Initial trial on antioxidant capability outside body
The experiment studied initially the capability of total saponins in Yemugua to clear hydroxyl free radical (OH) produced by Fenton reaction and to clear superoxide anion (O_2~-·). The results manifested that the capability to clear hydroxyl free radical (·OH) was stronger than to clear superoxide anion (O_2~-·).
1．野木瓜总皂苷的含量测定
选用齐墩果酸为标准品，采用分光光度法，以5％冰乙酸-香草醛溶液和高氯酸为显色剂，在545 nm处测定吸光度。以齐墩果酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线，经计算得回归方程Y=0.04667 X+0.08025(r=0.9994)，方程在4～28μg／mL范围内线性关系良好，以此计算野木瓜中总皂苷的含量。经方法学实验结果显示，在1h内吸收值稳定，RSD为0.78％；精密度和重现性良好，RSD分别0.66％和1.41％；平均回收率为102.21％(n=5)，RSD为2.23％。表明本法简便灵敏，重现性良好，方法可靠，可作为野木瓜总皂苷的定量方法。
2．野木瓜总皂苷浸提条件的优化
以乙醇为提取溶剂，采用浸提法来考察影响野木瓜总皂苷提取率的因素。在单因素实验的基础上，用正交实验确定了最佳的提取条件。结果表明，以75％乙醇为提取溶剂，料液比1∶15，提取温度为70℃，时间为60 min，pH值为7时总皂苷的提取率最高。
3．野木瓜总皂苷纯化工艺的优化
采用D_(101)大孔树脂柱(R15×H200 mm，干树脂质量4.000 g)分离纯化野木瓜总皂苷，最佳的吸附参数是：上样液浓度8.86 mg／mL，流速1 mL／min，pH5左右，最大进样体积不超过18 mL。最佳的洗脱条件是：先用100 mL蒸馏水洗去杂质，再用100 mL 50％乙醇洗脱野木瓜总皂苷，洗脱流速1.5 mL／min，收集50％乙醇洗脱部分。研究结果表明，未纯化前总固物中总皂苷的含量为33.5％，纯化后总固物中的野木瓜总皂苷含量为60.3％，精制度达179.2％，且洗脱率达80％以上。从精制度、纯化率等方面考虑，该工艺适宜于野木瓜总皂苷的分离及纯化。
4．野木瓜总皂苷抗氧化活性的初步研究
体外抗氧化活性实验表明，野木瓜总皂苷具有清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力。且清除能力与样液浓度呈量效关系，其中对羟基自由基的能力较强，而对超氧阴离子的清除能力不及同浓度的V_c能力强。
Yemugua, a specialized resource of ZhengAn county in GuiZhou province, belongs to Rosaceae Chaenomelses plant. It implies various organic acids, amino acids, minerals, vitamins, traceelements, and contains some active substances such as trierpenoid saponins, flavoxate , polysaccharides, SOD, and so on.Being a natural plant used as both medicines and foods, it has been applied widely on clinical treat and health protection. At present, the research aimed to Yemugua is concentrated mainly on exploitation of common food , and systematic research on extraction and purification for its active substance remains unreported. The article studied majorly technology conditions of extracting and purifying total saponins, established content determination method of total saponins for Yemugua,posed the best technology parameters suitable to extract and purify for total saponins. In addition, studied initially and tried on its antioxidant capability outside body.The research work and experiment results are as follows:
1. Content determination method of total saponins for Yemugua
By selecting oleanolic acid as control article, colorating with 5% vanillin-CH_3COOH and HClO_4, determined absorbability in the point of 545nm with ultraviolet-visible absorption spectroscopy and calculated total saponin content of Yemugua. The results showed that the method is linear in the range of 20～140μg(r=0.9994), absorbability stability within 1h, RSD 0.78%, moreover, the average recovery 102.21%, RSD 2.23%(n=5). The conclusion is that the method is sensitive and reliable, which may be used for the quality control of Yemugua.
2. The optimization of extraction conditions for total saponins of Yemugua
Influence factors about extraction ratio of total saponins had been studied by selecting alcohol as solvent and taking method of immersion to withdraw. On the basis of single factor experiment, used orthogonal design to confirm the best extraction parameters. As a result, when alcohol level 75%, solid-liquid proportionl:15,temperature and time respectively 70℃and 60min, the extraction ratio can reach to the highest level.
3. The optimization of purification process for total saponins of Yemugua
To use D_(101) macroporous resin (column specification:R15×H200 mm , resin weight :4.000 g) for purifying total saponins of Yemugua, the optimal adsorption conditions were concentration of feed 8.86mg/mL, feeding rate 1 mL/min, PH value 5, the limited feed volume 18mL. The optimal de-adsorption parameters were alcohol concentration 50 %, elution volume both of water and alcohol were 100 mL, elution rate 1.5 mL/min,then the part eluted by 50 %alcohol were gathered. The experimental results showed that total saponins of Yemugua in the solid extract could reach 60.3 %, well above unpurified of 33.5 %, the refine ratio and elution ratio reached respectively 179.2 % and above 80 %.On the whole, the optimal conditions are suitable for separation and purification of total saponins in Yemugua.
4. Initial trial on antioxidant capability outside body
The experiment studied initially the capability of total saponins in Yemugua to clear hydroxyl free radical (OH) produced by Fenton reaction and to clear superoxide anion (O_2~-·). The results manifested that the capability to clear hydroxyl free radical (·OH) was stronger than to clear superoxide anion (O_2~-·).
引文
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