基于蛋白质组学的脾虚大鼠脾失健运机理的实验研究
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摘要
目的：
在中医脾藏象理论的指导下,引入蛋白质组学技术研究脾虚证脾失健运的机理。在观测脾虚大鼠血清胃泌素含量变化和血清淀粉酶、回肠组织琥珀酸脱氢酶和钠钾ATP酶活力变化的同时,利用蛋白质组学技术全面系统地分析其回肠组织蛋白质表达谱的变化,从系统生物学角度探讨脾虚证脾失健运的物质基础和发生机制。
材料与方法：
88只SPF级3月龄SD大白鼠随机分成7组,即正常对照组、脾气虚模型组、脾气虚中药对照组、脾阳虚模型组、脾阳虚中药对照组、脾阴虚模型组和脾阴虚中药对照组。造模期间各组大鼠采用标准固体饲料喂饲,模型组给药的同时正常组灌饲等量生理盐水。造模共计16天,1-8天采用劳倦过度结合饮食不节的方法建立脾气虚模型；9-16天采用劳倦过度、饮食不节与药物损伤相结合的方法建立脾阳虚、脾阴虚模型：在模型组造模成功的基础上施加中药治疗,其中脾气虚中药对照组采用补中益气汤治疗,脾阳虚中药对照组采用附子理中汤治疗,脾阴虚中药对照组采用理脾阴正方治疗,具体方法为按1ml/100g剂量灌胃,日一次；在造模的第8天和第16天运用模糊数学的方法对模型进行评价,符合纳入标准的动物取材备检。
形态学观察方面,采用100×光镜观察各组大鼠胃和小肠病理学改变；生化指标检测方面,采用放射免疫方法测定血清胃泌素和血清淀粉酶的变化,用比色法测定琥珀酸脱氢酶和钠钾ATP酶活性的变化；回肠组织蛋白质检测方面,采用双向电泳法分离差异表达的蛋白,凝胶银染后经选点、酶切和质谱分析,用MASCOT软件在蛋白质数据库中搜索肽质量指纹谱数据并确定蛋白质。
结果：
1.与正常组比较,各模型组大鼠血清淀粉酶活力显著降低(P<0.01),其中脾阳虚模型组降低幅度最大,其次是脾气虚模型组,脾阴虚模型组降低幅度最小；各中药对照组经中药对证治疗后血清淀粉酶活力有所增强。
2.与正常组比较,各模型组大鼠血清胃泌素含量显著增高(P<0.05),其中脾阳虚模型组增高幅度最大(P<0.01),其次是脾阴虚模型组(P<0.01),脾气虚模型组大鼠增高幅度最小(P<0.05)；各中药对照组经中药对证治疗后血清胃泌素含量均有降低。
3.100×光镜下胃肠组织病理形态学观察结果显示：①正常组大鼠胃底黏膜各层结构完整,纹理清晰；回肠组织黏膜内腺体排列整齐；②各模型组大鼠胃底黏膜结构紊乱,结构不清,可见坏死渗出等病理改变；回肠绒毛变矮或消失,可见炎性细胞浸润、黏膜水肿；③各中药对照组经对证治疗后胃肠组织结构基本恢复正常,未见明显破坏。
4.与正常组比较,各模型组大鼠Na+-K+-ATPase活力显著降低(P<0.01),其中脾气虚模型组降低幅度最大,其次是脾阳虚模型组,脾阴虚模型组降低幅度最小；各中药对照组经中药对证治疗后Na+-K+-ATPase活力有所增强。
5.与正常组比较,各模型组大鼠SDH活力均发生不同程度降低,但差异无统计学意义(P>0.05)；各中药对照组经中药对证治疗后SDH活力有所增强。
6.脾虚大鼠蛋白质组学检测结果发现了205个有差异性表达的蛋白点,经选点加酶切及质谱鉴定,本次实验鉴定出22种与脾虚发生相关的蛋白质,其中7种蛋白表达下调,15种蛋白表达上调。脾气虚模型组有3种蛋白质差异性表达,分别是表达下调的白蛋白,表达上调的胰蛋白酶和葡萄糖调节蛋白78；脾阳虚模型组有12种蛋白质差异性表达,分别是表达下调的角蛋白19、甘油醛三磷酸脱氢酶、肌动蛋白和角蛋白1,表达上调的蛋白二硫键异构酶A3、埃兹蛋白、假定未知蛋白、磷酸化应激诱导蛋白、丙酮酸激酶、结蛋白、角蛋白8和蛋白质异戊烯基转移酶；脾阴虚模型组有7种蛋白质差异性表达,分别是表达下调的肌动蛋白、热休克蛋白,表达上调的钙联蛋白、乌头酸水合酶、Papss2、过氧化氢酶和乙醇脱氢酶。
结论：
1.根据中医病因理论,采用劳倦过度结合饮食不节的方法可成功诱导脾气虚大鼠模型,在此基础上施加药物损伤法可以成功诱导脾阳虚和脾阴虚大鼠模型。
2.脾失健运可表现出血清淀粉酶、钠钾ATP酶、琥珀酸脱氢酶活力下降和血清胃泌素含量升高,提示脾失健运与消化吸收功能减弱以及能量的合成代谢能力下降关系密切。
3.脾失健运主要与物质代谢、组织构成、细胞信号转导、细胞死亡和增殖方面相关的蛋白质功能异常有关,其中绝大部分与糖、脂类、蛋白质代谢过程密切相关。
4.脾失健运的发生与细胞内Ca2+超载和细胞膜损伤密切相关。在继发性病理机制中,脾气虚或与血液循环障碍关系更为密切,印证了中医学“气为血之帅”、“气虚则血虚”的理论；脾阳虚或与细胞骨架损伤和糖代谢异常的关系更为密切,印证了中医学“阳虚为气虚之极”的理论；脾阴虚或与过氧化损伤的关系更为密切,印证了中医学“气虚日久伤阴”的理论。
Purpose:
Under the guidance of viscera-state doctrine of TCM, according to the proteome expression profile changes to discuss the foundations of spleen deficiency in modern biology.
Material and method:
Eighty-eight rats were randomly divided into7groups, i.e., the normal control group, the Pi-qi deficiency syndrome model group, the Pi-qi deficiency control group of TCM, the Pi-yang deficiency syndrome model group, the Pi-yang deficiency control group of TCM, the Pi-yin deficiency syndrome model group, the Pi-yin deficiency control group of TCM. The Pi-qi deficiency syndrome model was established using exerting excessive combined with irregular diet, on the basis of it, medical injury was used to established the Pi-yang and Pi-yin deficiency syndrome model. In control groups of TCM, Bu Zhong Yi Oi prescription was used to treat the Pi-qi deficiency syndrome rats, Fu Zi Li Zhong prescription was used to treat the Pi-yang deficiency syndrome rats, and Li Pi Yin Zheng prescription was used to treat the Pi-qi deficiency syndrome rats, gastric feeding,1mg/mL. The ileum tissues were separated after identified fuzzy method. The differentially expressed proteins were separated with two dimensional electrophoresis (2-DE), analyzed by Mass Spectrometry, and identified by MASCOT Software. At the same time, observed gastric and small intestinal pathological changes with light microscopic, determinated serum gastrin and amylase changes with radioimmunoassay method, SDH and Na+-K+-ATPase changes with colorimetry.
Results:
1. Compared with the normal group, the model group rats serum amylase activity was significantly reduced (P<0.01),the largest decline of Pi-yang deficiency model group, followed by the deficiency of Pi-yin deficiency model group. Pi-qi deficiency model group reduces the minimum amplitude;the control group of TCM syndrome by Chinese medicine treatment serum amylase vigor increased somewhat.
2. Compared with the normal group, the model group rats serum gastrin content increased significantly (P<0.05), which increases the maximum of Pi-yang deficiency model group (P <0.01), followed by Pi-yin deficiency model group (P<0.01), Pi-qi deficiency model rats increases the minimum (P<0.05); the control group of TCM syndrome by Chinese medicine treatment serum gastrin content decreased.
3.The results of100X light microscopy gastrointestinal pathology morphological observation showed:①normal rat fundic mucosa structure of each layer is complete, the texture is clear; ileal tissue mucous glands in the order;②the model group rat fundic mucosa structural disorder, structure is disorder, visible necrosis exudation and other pathological changes; ileal villus shorter or disappear, visible inflammatory cell infiltration, mucosal edema;③each medicine control group treatment to the syndrome after gastrointestinal tissue structure returned to normal, no obvious damage.
4. Compared with the normal group, the model group rats Na+-K+-ATPase activity was significantly reduced (P<0.01), the largest decline of Pi-qi deficiency model group, followed by Pi-yang deficiency,and Pi-yin deficiency model group reduced the minimum amplitude;the control group of TCM syndrome in traditional Chinese medicine treatment increased accordingly.
5.Compared with the normal group, the model group rats SDH activity were decreased in different degree, but the difference was not statistically significant (P>0.05);the control group of TCM syndrome in traditional Chinese medicine treatment increased accordingly.
6.205differentially expressed protein spots were found in this experiment and22were identified, in which,7proteins expressed decreased and15proteins expressed increased. There were3proteins differentially expressed in Pi-qi deficiency model group, respectively the decreased expression of albumin and increased expression of trypsin and glucose-regulated protein78;there were12proteins differentially expressed in Pi-yang deficiency model group, respectively the decreased expression of keratin19,glyceraldehyde three phosphate dehydrogenase, actin and cytokeratin1,and the increased expression of protein disulfide isomerase A3,ezrin, assuming unknown protein, stress induced protein phosphorylation, pyruvate kinase, keratin8and protein prenyl transferase;there were7proteins differentially expressed in Pi-in deficiency model group, respectively the decreased expression of actin, heat shock protein, and increased expression of calnexin, aconitate hydratase, Papss2, catalase and alcohol dehydrogenase.
Conclusion:
1.According to the etiology theory in TCM, the overstrain, improper diet and drug injury combined method can successfully induced Pi-qi deficiency, Pi-yang deficiency and Pi-yin deficiency rat model.
2. Spleen fails to main and substance could present increased GAS as well as decreased AMY, SDH and Na+-K+-ATPase,Which showed the ability of digestion and absorption had dropped off.
3. Spleen fails to main and substance was closely related with proteins function abnormalities in metabolism, cell signal transduction, cell death and proliferation, most of them with sugar, lipid, protein metabolism process.
4. Spleen fails to main and substance was mainly related with intracellular Ca2+overload. Pi-qi deficiency syndrome occured to endoplasmic reticulum stress and blood circulation speed reduction, Pi-yang deficiency syndrome occured to glucose metabolism, Pi-yin deficiency syndrome occured to lipid peroxidative injury more closely.
在中医脾藏象理论的指导下,引入蛋白质组学技术研究脾虚证脾失健运的机理。在观测脾虚大鼠血清胃泌素含量变化和血清淀粉酶、回肠组织琥珀酸脱氢酶和钠钾ATP酶活力变化的同时,利用蛋白质组学技术全面系统地分析其回肠组织蛋白质表达谱的变化,从系统生物学角度探讨脾虚证脾失健运的物质基础和发生机制。
材料与方法：
88只SPF级3月龄SD大白鼠随机分成7组,即正常对照组、脾气虚模型组、脾气虚中药对照组、脾阳虚模型组、脾阳虚中药对照组、脾阴虚模型组和脾阴虚中药对照组。造模期间各组大鼠采用标准固体饲料喂饲,模型组给药的同时正常组灌饲等量生理盐水。造模共计16天,1-8天采用劳倦过度结合饮食不节的方法建立脾气虚模型；9-16天采用劳倦过度、饮食不节与药物损伤相结合的方法建立脾阳虚、脾阴虚模型：在模型组造模成功的基础上施加中药治疗,其中脾气虚中药对照组采用补中益气汤治疗,脾阳虚中药对照组采用附子理中汤治疗,脾阴虚中药对照组采用理脾阴正方治疗,具体方法为按1ml/100g剂量灌胃,日一次；在造模的第8天和第16天运用模糊数学的方法对模型进行评价,符合纳入标准的动物取材备检。
形态学观察方面,采用100×光镜观察各组大鼠胃和小肠病理学改变；生化指标检测方面,采用放射免疫方法测定血清胃泌素和血清淀粉酶的变化,用比色法测定琥珀酸脱氢酶和钠钾ATP酶活性的变化；回肠组织蛋白质检测方面,采用双向电泳法分离差异表达的蛋白,凝胶银染后经选点、酶切和质谱分析,用MASCOT软件在蛋白质数据库中搜索肽质量指纹谱数据并确定蛋白质。
结果：
1.与正常组比较,各模型组大鼠血清淀粉酶活力显著降低(P<0.01),其中脾阳虚模型组降低幅度最大,其次是脾气虚模型组,脾阴虚模型组降低幅度最小；各中药对照组经中药对证治疗后血清淀粉酶活力有所增强。
2.与正常组比较,各模型组大鼠血清胃泌素含量显著增高(P<0.05),其中脾阳虚模型组增高幅度最大(P<0.01),其次是脾阴虚模型组(P<0.01),脾气虚模型组大鼠增高幅度最小(P<0.05)；各中药对照组经中药对证治疗后血清胃泌素含量均有降低。
3.100×光镜下胃肠组织病理形态学观察结果显示：①正常组大鼠胃底黏膜各层结构完整,纹理清晰；回肠组织黏膜内腺体排列整齐；②各模型组大鼠胃底黏膜结构紊乱,结构不清,可见坏死渗出等病理改变；回肠绒毛变矮或消失,可见炎性细胞浸润、黏膜水肿；③各中药对照组经对证治疗后胃肠组织结构基本恢复正常,未见明显破坏。
4.与正常组比较,各模型组大鼠Na+-K+-ATPase活力显著降低(P<0.01),其中脾气虚模型组降低幅度最大,其次是脾阳虚模型组,脾阴虚模型组降低幅度最小；各中药对照组经中药对证治疗后Na+-K+-ATPase活力有所增强。
5.与正常组比较,各模型组大鼠SDH活力均发生不同程度降低,但差异无统计学意义(P>0.05)；各中药对照组经中药对证治疗后SDH活力有所增强。
6.脾虚大鼠蛋白质组学检测结果发现了205个有差异性表达的蛋白点,经选点加酶切及质谱鉴定,本次实验鉴定出22种与脾虚发生相关的蛋白质,其中7种蛋白表达下调,15种蛋白表达上调。脾气虚模型组有3种蛋白质差异性表达,分别是表达下调的白蛋白,表达上调的胰蛋白酶和葡萄糖调节蛋白78；脾阳虚模型组有12种蛋白质差异性表达,分别是表达下调的角蛋白19、甘油醛三磷酸脱氢酶、肌动蛋白和角蛋白1,表达上调的蛋白二硫键异构酶A3、埃兹蛋白、假定未知蛋白、磷酸化应激诱导蛋白、丙酮酸激酶、结蛋白、角蛋白8和蛋白质异戊烯基转移酶；脾阴虚模型组有7种蛋白质差异性表达,分别是表达下调的肌动蛋白、热休克蛋白,表达上调的钙联蛋白、乌头酸水合酶、Papss2、过氧化氢酶和乙醇脱氢酶。
结论：
1.根据中医病因理论,采用劳倦过度结合饮食不节的方法可成功诱导脾气虚大鼠模型,在此基础上施加药物损伤法可以成功诱导脾阳虚和脾阴虚大鼠模型。
2.脾失健运可表现出血清淀粉酶、钠钾ATP酶、琥珀酸脱氢酶活力下降和血清胃泌素含量升高,提示脾失健运与消化吸收功能减弱以及能量的合成代谢能力下降关系密切。
3.脾失健运主要与物质代谢、组织构成、细胞信号转导、细胞死亡和增殖方面相关的蛋白质功能异常有关,其中绝大部分与糖、脂类、蛋白质代谢过程密切相关。
4.脾失健运的发生与细胞内Ca2+超载和细胞膜损伤密切相关。在继发性病理机制中,脾气虚或与血液循环障碍关系更为密切,印证了中医学“气为血之帅”、“气虚则血虚”的理论；脾阳虚或与细胞骨架损伤和糖代谢异常的关系更为密切,印证了中医学“阳虚为气虚之极”的理论；脾阴虚或与过氧化损伤的关系更为密切,印证了中医学“气虚日久伤阴”的理论。
Purpose:
Under the guidance of viscera-state doctrine of TCM, according to the proteome expression profile changes to discuss the foundations of spleen deficiency in modern biology.
Material and method:
Eighty-eight rats were randomly divided into7groups, i.e., the normal control group, the Pi-qi deficiency syndrome model group, the Pi-qi deficiency control group of TCM, the Pi-yang deficiency syndrome model group, the Pi-yang deficiency control group of TCM, the Pi-yin deficiency syndrome model group, the Pi-yin deficiency control group of TCM. The Pi-qi deficiency syndrome model was established using exerting excessive combined with irregular diet, on the basis of it, medical injury was used to established the Pi-yang and Pi-yin deficiency syndrome model. In control groups of TCM, Bu Zhong Yi Oi prescription was used to treat the Pi-qi deficiency syndrome rats, Fu Zi Li Zhong prescription was used to treat the Pi-yang deficiency syndrome rats, and Li Pi Yin Zheng prescription was used to treat the Pi-qi deficiency syndrome rats, gastric feeding,1mg/mL. The ileum tissues were separated after identified fuzzy method. The differentially expressed proteins were separated with two dimensional electrophoresis (2-DE), analyzed by Mass Spectrometry, and identified by MASCOT Software. At the same time, observed gastric and small intestinal pathological changes with light microscopic, determinated serum gastrin and amylase changes with radioimmunoassay method, SDH and Na+-K+-ATPase changes with colorimetry.
Results:
1. Compared with the normal group, the model group rats serum amylase activity was significantly reduced (P<0.01),the largest decline of Pi-yang deficiency model group, followed by the deficiency of Pi-yin deficiency model group. Pi-qi deficiency model group reduces the minimum amplitude;the control group of TCM syndrome by Chinese medicine treatment serum amylase vigor increased somewhat.
2. Compared with the normal group, the model group rats serum gastrin content increased significantly (P<0.05), which increases the maximum of Pi-yang deficiency model group (P <0.01), followed by Pi-yin deficiency model group (P<0.01), Pi-qi deficiency model rats increases the minimum (P<0.05); the control group of TCM syndrome by Chinese medicine treatment serum gastrin content decreased.
3.The results of100X light microscopy gastrointestinal pathology morphological observation showed:①normal rat fundic mucosa structure of each layer is complete, the texture is clear; ileal tissue mucous glands in the order;②the model group rat fundic mucosa structural disorder, structure is disorder, visible necrosis exudation and other pathological changes; ileal villus shorter or disappear, visible inflammatory cell infiltration, mucosal edema;③each medicine control group treatment to the syndrome after gastrointestinal tissue structure returned to normal, no obvious damage.
4. Compared with the normal group, the model group rats Na+-K+-ATPase activity was significantly reduced (P<0.01), the largest decline of Pi-qi deficiency model group, followed by Pi-yang deficiency,and Pi-yin deficiency model group reduced the minimum amplitude;the control group of TCM syndrome in traditional Chinese medicine treatment increased accordingly.
5.Compared with the normal group, the model group rats SDH activity were decreased in different degree, but the difference was not statistically significant (P>0.05);the control group of TCM syndrome in traditional Chinese medicine treatment increased accordingly.
6.205differentially expressed protein spots were found in this experiment and22were identified, in which,7proteins expressed decreased and15proteins expressed increased. There were3proteins differentially expressed in Pi-qi deficiency model group, respectively the decreased expression of albumin and increased expression of trypsin and glucose-regulated protein78;there were12proteins differentially expressed in Pi-yang deficiency model group, respectively the decreased expression of keratin19,glyceraldehyde three phosphate dehydrogenase, actin and cytokeratin1,and the increased expression of protein disulfide isomerase A3,ezrin, assuming unknown protein, stress induced protein phosphorylation, pyruvate kinase, keratin8and protein prenyl transferase;there were7proteins differentially expressed in Pi-in deficiency model group, respectively the decreased expression of actin, heat shock protein, and increased expression of calnexin, aconitate hydratase, Papss2, catalase and alcohol dehydrogenase.
Conclusion:
1.According to the etiology theory in TCM, the overstrain, improper diet and drug injury combined method can successfully induced Pi-qi deficiency, Pi-yang deficiency and Pi-yin deficiency rat model.
2. Spleen fails to main and substance could present increased GAS as well as decreased AMY, SDH and Na+-K+-ATPase,Which showed the ability of digestion and absorption had dropped off.
3. Spleen fails to main and substance was closely related with proteins function abnormalities in metabolism, cell signal transduction, cell death and proliferation, most of them with sugar, lipid, protein metabolism process.
4. Spleen fails to main and substance was mainly related with intracellular Ca2+overload. Pi-qi deficiency syndrome occured to endoplasmic reticulum stress and blood circulation speed reduction, Pi-yang deficiency syndrome occured to glucose metabolism, Pi-yin deficiency syndrome occured to lipid peroxidative injury more closely.
引文
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