食用营养酵母的研究
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摘要
本论文针对营养酵母出发菌株的筛选，高核黄素含量菌株的诱变育种及营养酵母摇瓶培养条件、生产工艺进行了研究。
通过对面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)(BY-1～8)，假丝酵母(Candida utilis)(CY-1～11)，啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)(SY-1～10)，奶酒酵母(Saccharomyces uvarum)(MY-1)等四种酵母的核黄素、自溶浸出物比率进行研究，选定了核黄素含量及自溶浸出物比率较高的奶酒酵母(MY-1)作为出发菌株。
将MY-1经连续3次EMS诱变，依次选育富含核黄素的腺嘌呤营养缺陷型菌株(M1-3)和腺嘌呤缺陷型的回复突变株(M2-8)。对所得的菌株进一步进行抗铵突变株的选育，最终得到富含核黄素的营养酵母突变株(M3-20)，其核黄素含量达到245.56mg／kg，与出发菌株核黄素含量相比提高了约150％。
在优化培养基成分时，用两水平析因试验及快速登高法等方法设计实验方案，并结合SAS，Origin等统计软件对实验数据进行析因分析和响应曲面分析。得出生产富含核黄素酵母的优化结果如下：
(1)种子培养基：硫酸铵0.86g／L，酵母粉10g／L，葡萄糖40g／L，磷酸二氢钾0.6g／L，硫酸镁0.5g／L，pH自然。
(2)发酵培养基：葡萄糖35.6g／L，酵母粉67g／L，(NH_4)_2SO_4 1g／L，KH_2PO_40.2g／L，MgSO_4.7H_2O 0.5g／L，NaCl 1g／L，ZnSO_4 0.4mg／L，FeSO_4 4mg／L，COSO_411.5mg／L，甘氨酸6g／L，豆油10g／L，pH6.0。
(3)发酵条件：种龄7小时，装液量(80／500mlΔ)，接种量10％，培养温度30℃，200r／min，16小时。
对得到的富含核黄素菌株进行了生产工艺研究，内容包括克雷布特效应试验、补糖发酵试验及确定流加培养工艺试验等。结果表明，对于分批发酵，糖浓度5％时，酵母得率最高，且此糖浓度对于发酵前期酵母生长没有抑制作用。在周期为16小时的流加培养中，研究表明在培养过程中流加豆油和甘氨酸效果比较好，细胞生物量和核黄素含量分别达到33.2g／L和237mg／kg，为工业化生产富含核黄素的营养酵母奠定了基础。
In the paper, screening of nutritional yeast parent strains, mutation of rich riboflavin strain, shake-flashing culture conditions as well as fermentation technology of nutritional yeast were studied.
Baker yeast(Saccharomyces cerevisiae) BY-1-8, Candida yeast(Candida utilis) CY-1-11, beer yeast( Saccharomyces carlsbergensis) SY-1-10 and milk brewer yeast (Saccharomyces uvarum) MY-1 were used for a group of tests. Through the tests, the yeast strain (MY-1), which had the maximum riboflavin and extraction, was selected. Through three-step continual EMS mutation, the adenine autotrophy strain(Ml-3) and the adenine-requiring revertant strain(M2-8) were screened successively, and the resistant strain(M3-20) to ammonium ion variant was further screened. Then the strain (M3-20), which has 245. 56mg/kg riboflavin, was got. Compared with parent strain, the riboflavin content of the mutation strain was increased by 150%.
Shake-flash culture conditions of nutritional yeast were studied with mutant M3-20.Two-lever-factor tests and climb-quickly methods were used to design experiment. At the same time, according to factor analysis and the response surface analysis, data were analyzed with statistical software, such as SAS, Origin. In the end we got an optimal culture conditions as follows.
(1) Seed medium: yeastponder10g/L, glucose 40g/L, (NH4)2SO4 0.86g/L, KH2PO40.6g/L,MgSO4.7H2O0.5g/L ,pH spontaneous combustion.
(2) Fermentation medium: glucose 35.6g/L, yeastponder 67g/L, bean oil 10g/L, glycine 6g/L,(NH4)2SO4lg/L,KH2PO40.2g/L,MgSO4.7H2O0.5g/L, NaCl lg/L,ZnSO40.4mg/L,FeSO44mg/L,CoSO411.5mg/L,pH6.0.
(3)Fermentation conditions: breed cultivation time 7h,loading size (80/500ml A ),inoculation size10%,cultivation temperature 30 C ,200r/min,the optimum culture time was 16h.
The high-riboflavin containing strain was used to study the fermentation process, including the experiment of Crabtree effect and the technology of feeding culture, etc. The results showed that during the batch fermentation, when the glucose concentration was 5%, yeast cell concentration is sovereign, and the glucose concentration has no remarkable inhibition to the initial stage of fermentation. During the flow-plus culture of 16 hour, the results showed that effects of feeding oil and glycine were good, the biomass and content of riboflavin
was 33.2g/L and 237mg/kg respectively. The feet laid solid foundation for production of nutritional yeast full of riboflavin.
通过对面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)(BY-1～8)，假丝酵母(Candida utilis)(CY-1～11)，啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)(SY-1～10)，奶酒酵母(Saccharomyces uvarum)(MY-1)等四种酵母的核黄素、自溶浸出物比率进行研究，选定了核黄素含量及自溶浸出物比率较高的奶酒酵母(MY-1)作为出发菌株。
将MY-1经连续3次EMS诱变，依次选育富含核黄素的腺嘌呤营养缺陷型菌株(M1-3)和腺嘌呤缺陷型的回复突变株(M2-8)。对所得的菌株进一步进行抗铵突变株的选育，最终得到富含核黄素的营养酵母突变株(M3-20)，其核黄素含量达到245.56mg／kg，与出发菌株核黄素含量相比提高了约150％。
在优化培养基成分时，用两水平析因试验及快速登高法等方法设计实验方案，并结合SAS，Origin等统计软件对实验数据进行析因分析和响应曲面分析。得出生产富含核黄素酵母的优化结果如下：
(1)种子培养基：硫酸铵0.86g／L，酵母粉10g／L，葡萄糖40g／L，磷酸二氢钾0.6g／L，硫酸镁0.5g／L，pH自然。
(2)发酵培养基：葡萄糖35.6g／L，酵母粉67g／L，(NH_4)_2SO_4 1g／L，KH_2PO_40.2g／L，MgSO_4.7H_2O 0.5g／L，NaCl 1g／L，ZnSO_4 0.4mg／L，FeSO_4 4mg／L，COSO_411.5mg／L，甘氨酸6g／L，豆油10g／L，pH6.0。
(3)发酵条件：种龄7小时，装液量(80／500mlΔ)，接种量10％，培养温度30℃，200r／min，16小时。
对得到的富含核黄素菌株进行了生产工艺研究，内容包括克雷布特效应试验、补糖发酵试验及确定流加培养工艺试验等。结果表明，对于分批发酵，糖浓度5％时，酵母得率最高，且此糖浓度对于发酵前期酵母生长没有抑制作用。在周期为16小时的流加培养中，研究表明在培养过程中流加豆油和甘氨酸效果比较好，细胞生物量和核黄素含量分别达到33.2g／L和237mg／kg，为工业化生产富含核黄素的营养酵母奠定了基础。
In the paper, screening of nutritional yeast parent strains, mutation of rich riboflavin strain, shake-flashing culture conditions as well as fermentation technology of nutritional yeast were studied.
Baker yeast(Saccharomyces cerevisiae) BY-1-8, Candida yeast(Candida utilis) CY-1-11, beer yeast( Saccharomyces carlsbergensis) SY-1-10 and milk brewer yeast (Saccharomyces uvarum) MY-1 were used for a group of tests. Through the tests, the yeast strain (MY-1), which had the maximum riboflavin and extraction, was selected. Through three-step continual EMS mutation, the adenine autotrophy strain(Ml-3) and the adenine-requiring revertant strain(M2-8) were screened successively, and the resistant strain(M3-20) to ammonium ion variant was further screened. Then the strain (M3-20), which has 245. 56mg/kg riboflavin, was got. Compared with parent strain, the riboflavin content of the mutation strain was increased by 150%.
Shake-flash culture conditions of nutritional yeast were studied with mutant M3-20.Two-lever-factor tests and climb-quickly methods were used to design experiment. At the same time, according to factor analysis and the response surface analysis, data were analyzed with statistical software, such as SAS, Origin. In the end we got an optimal culture conditions as follows.
(1) Seed medium: yeastponder10g/L, glucose 40g/L, (NH4)2SO4 0.86g/L, KH2PO40.6g/L,MgSO4.7H2O0.5g/L ,pH spontaneous combustion.
(2) Fermentation medium: glucose 35.6g/L, yeastponder 67g/L, bean oil 10g/L, glycine 6g/L,(NH4)2SO4lg/L,KH2PO40.2g/L,MgSO4.7H2O0.5g/L, NaCl lg/L,ZnSO40.4mg/L,FeSO44mg/L,CoSO411.5mg/L,pH6.0.
(3)Fermentation conditions: breed cultivation time 7h,loading size (80/500ml A ),inoculation size10%,cultivation temperature 30 C ,200r/min,the optimum culture time was 16h.
The high-riboflavin containing strain was used to study the fermentation process, including the experiment of Crabtree effect and the technology of feeding culture, etc. The results showed that during the batch fermentation, when the glucose concentration was 5%, yeast cell concentration is sovereign, and the glucose concentration has no remarkable inhibition to the initial stage of fermentation. During the flow-plus culture of 16 hour, the results showed that effects of feeding oil and glycine were good, the biomass and content of riboflavin
was 33.2g/L and 237mg/kg respectively. The feet laid solid foundation for production of nutritional yeast full of riboflavin.
引文
1 曹克嘉．国内外单细胞酵母工业的发展现状与趋向[J]．天津轻工，1991，(4)：24～26．
2 华炳生等．酵母在医药工业中的应用[J]．工业微生物，1986，(3)：39～40．
3 丁满生．国内外针对酵母泥回收处理的研究动态[J]．酿酒科技，2001，(4)：44～49．
4 冯霖，江泉．浅谈我国啤酒厂废弃物综合利用的现状及发展趋势[J]．酿酒科技，1995，(5)：33～34．
5 诸镇祺．啤酒酵母的开发应用[J]．酿酒，1996，(3)：7～9．
6 李小全等．法国实用酵母[J]．工业微生物，1988，(10)：33～36．
7 王秀道．啤酒酵母的干燥和利用[J]．酿酒科技，1998，(1)：70～71．
8 徐万祥．维生素发酵[J]．微生物通报，1990，(3)：15～19．
9 Simard, et al. Process of the Process for Brewer's Yeast Debittering. U.S.Pat.No.571, 665, 3.
10 Yang. Organomatallic-metabolizing yeast. U.S.Pat.No.6, 140, 107.
11 K.J.Blackwell, I.singleton, J.M.Tobin. Metal Cation Uptake by Yeast: A Review[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1995,(43):579～584.
12 M.阿诺尔德，P.杨．锗酵母膳食营养添加剂．CN. Pat. No.1177301A.
13 唐博恒，莫卓寿，黄诗旦．高锗酵母的研究[J]．解放军预防医学杂志，1994，12(3)：179～183．
14 陈远才，方扬帆．营养元素酵母生产工艺．CN.Pat.No.1066290A.
15 Kawai, et al. Process of the Preparation of Riboflavin. U.S.Pat.No.4, 794, 081.
16 Heefner, Donald. Efficient Riboflavin Production with Yeast. U.S.Pat.No.5, 231, 007.
17 Usui, et al. Process for Producing Riboflavin by Fermentation. U.S.Pat.No.5, 334, 510.
18 李庆余．维生素B2产生菌原生质体诱变选育[J]．微生物通报，1990，(4)：23～26．
19 Matsuyama, Akinobu. Process for Preparation of Riboflavin. U.S.Pat. No.5, 126, 248.
20 胡运权，张宗浩．试验设计方法[M]．哈尔滨工业大学出版社，1997．
21 马逢时，何良才．应用概率统计[M]．北京：高等教育出版社，1989．
22 Helene Boze, G.Moulin and P.Galzy. Production of Food and Fooder yeasts[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 1992,12(1/2):65～85.
23 Tijen ozbas, Tiilin kutsal. Effects of Growth Factors on Riboflavin Production by
Ashbua gossypii[J]. Enzyme Microb. technol, 1991,(13):594～596．
24 李寅，陈坚，宋祺，Yoshio Katakura, 伦世仪．高发酵活力面包酵母的高产率流加培养策略研究[J]．生物工程学报，1997，13(2)：160～167．
25 王林静．核黄素与健康[J]．广东药学院学报，2000，16(3)：223～246．
26 九十年代中国人群的膳食与营养状况[J]．营养学报，1995，17(2)：1～2．
27 郑建仙．功能性食品(第二卷)[M]．北京：中国轻工业出版社，1999：272～278．
28 和田 良树．健康食品素材酵母利用[J]．New Food Industry, 1998，40(4)：11～16．
29 新田 酷司．健康食品素材酵母[J]．New Food Industry, 1999，14(4)：17～22．
30 姜小山，孙国萍，王淑君，赖林翰．核黄素产生菌阿舒假囊酵母抗反馈抑制突变株的选育[J]．微生物学报，1997，37(2)：95～100．
31 Gyure; Dale C.Riboflavin Comopsition and Method for Productions. U.S.Pat.No.5, 034, 389.
32 Peter Nielsen, Gerhand et al[J]. Biosynthesis of Riboflavin[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1986,261(8):3661～3669.
33 Rainer Volk, Adelbert Bacher. Studies on the 4～carbon Precursor in the Biosynthesis of Riboflavin[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1990,265(32):19479～19485.
34 Rainer Volk, Adelbert Bacher. Biosythesis of Riboflavin[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1991,266(31):20610～20618.
35 Gerhard Neuuberger, Adelbert Bacher. Biosythesis of Riboflavin. Biosynthesis of Riboflavin[J]. Biochemical and Biophysical Reserch Communications, 1985,127(1):175～181.
36 Gerhard Neuberger, Adelbert Bacher. Biosynthesis of Riboflavin[J]. Biochemical and Biophysical Reserch Communications 1986,139(3):1111～1116.
36 田中信男．抗菌素的作用机制-抗菌和抗癌作用的分子生物学[M]．北京：科学出版社，1977．
37 L.Y.巴布亚克．酵母中核黄素的过量生产．CN.Pat.No.1232872A.
38 张星元，王琴．阿舒假囊酵母过量合成核黄素性能的改良[J]．无锡轻工大学学报，1997，16(3)：14～19．
39 黄伟坤．食品检验与分析[M]．北京：中国轻工业出版社，1993：85～86．
40 刘湄．耐高糖面包酵母的研究．天津轻工业学院硕士学位论文，2000，12．
41 天津轻工业学院等三校合编．工业发酵分析[M]．北京：中国轻工业出版社，
1979：1～146．
42 宁正详．食品成分分析手册[M]．北京：中国轻工业出版社，1998：88．
43 蔡武斌，袁厚积．生物物质常用化学分析法[M]．北京：科学出版社，1982：230～231．
44 G.Andreu, M.D.Benaiges. A Simple Method for RNA Extraction from Yeasts. [J]Biotechnology and Bioengineening, 1988,(32):927～929.
45 [日]微生物研究法讨论会编．程光胜，李玲阁，张启光等译．微生物实验法[M]．北京：科学出版社，1981：10～161．
46 杜连祥．工业微生物学实验技术[M]．天津：天津科学技术出版社，1992：168～192．
47 肖冬光，丁匀成，邹海晏．酿酒活性干酵母的生产应用技术[M]．内蒙古：内蒙古人民出版社，1994：24～25．
48 石磊．试验设计基础[M]．重庆：重庆大学出版社，1997：104～120．
49 沈邦兴．工程实验设计[M]．武昌：测绘出版社，1990．
50 胡良平．实用统计分析教程[M]．北京：军事医学出版社，2001：541～550．
51 Douglas C.Matgomery (美) 汪仁官 陈荣昭译．实验设计与分析[M]．北京：中国统计出版社，1998：298～640．
52 欧竑宇，贾士儒．SAS软件在微生物培养条件优化中的应用[J]．天津轻工业学报，2001(1)：14～17．
53 惠大丰，姜长鉴．统计分析系统SAS软件实用教程[M]．北京航空航天大学出版社，1996．
54 董大钧．SAS统计分析[M]．大连：辽宁科学出版社，1996．
55 Foster, Edward W.Riboflabin Producing Strains of Microorganisms. U.S.Pat.No.5, 120, 655.
56 李嵘．发酵法生产核黄素[J]．无锡轻工大学学报，1997，16(1)：14～18．
57 张星元，王琴．代谢调节理论指导下的核黄素发酵条件[J]．无锡轻工大学学报，1997，16(4)：1～6．
58 史媛英．高活性干酸奶发酵剂的研究．天津轻工业学院硕士学位论文，1998．
59 I.M.Tamer, M.Ozilgen, and S.Ungan. Kinetics of Riboflavin Production by Brewers'yeast[J]. Enzyme Microb. technol, 1988,(11):754～756.
60 史传珉，王家林．发酵过程通氧对酵母特性的影响[J]．酿酒，1999，(6)：50～52．
61 陆文清，章克昌，吴佩踪．核黄素产生菌T-30补料发酵[J]．无锡轻工大学学报，1999，18(1)：1～5．
2 华炳生等．酵母在医药工业中的应用[J]．工业微生物，1986，(3)：39～40．
3 丁满生．国内外针对酵母泥回收处理的研究动态[J]．酿酒科技，2001，(4)：44～49．
4 冯霖，江泉．浅谈我国啤酒厂废弃物综合利用的现状及发展趋势[J]．酿酒科技，1995，(5)：33～34．
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9 Simard, et al. Process of the Process for Brewer's Yeast Debittering. U.S.Pat.No.571, 665, 3.
10 Yang. Organomatallic-metabolizing yeast. U.S.Pat.No.6, 140, 107.
11 K.J.Blackwell, I.singleton, J.M.Tobin. Metal Cation Uptake by Yeast: A Review[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1995,(43):579～584.
12 M.阿诺尔德，P.杨．锗酵母膳食营养添加剂．CN. Pat. No.1177301A.
13 唐博恒，莫卓寿，黄诗旦．高锗酵母的研究[J]．解放军预防医学杂志，1994，12(3)：179～183．
14 陈远才，方扬帆．营养元素酵母生产工艺．CN.Pat.No.1066290A.
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16 Heefner, Donald. Efficient Riboflavin Production with Yeast. U.S.Pat.No.5, 231, 007.
17 Usui, et al. Process for Producing Riboflavin by Fermentation. U.S.Pat.No.5, 334, 510.
18 李庆余．维生素B2产生菌原生质体诱变选育[J]．微生物通报，1990，(4)：23～26．
19 Matsuyama, Akinobu. Process for Preparation of Riboflavin. U.S.Pat. No.5, 126, 248.
20 胡运权，张宗浩．试验设计方法[M]．哈尔滨工业大学出版社，1997．
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23 Tijen ozbas, Tiilin kutsal. Effects of Growth Factors on Riboflavin Production by
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24 李寅，陈坚，宋祺，Yoshio Katakura, 伦世仪．高发酵活力面包酵母的高产率流加培养策略研究[J]．生物工程学报，1997，13(2)：160～167．
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27 郑建仙．功能性食品(第二卷)[M]．北京：中国轻工业出版社，1999：272～278．
28 和田 良树．健康食品素材酵母利用[J]．New Food Industry, 1998，40(4)：11～16．
29 新田 酷司．健康食品素材酵母[J]．New Food Industry, 1999，14(4)：17～22．
30 姜小山，孙国萍，王淑君，赖林翰．核黄素产生菌阿舒假囊酵母抗反馈抑制突变株的选育[J]．微生物学报，1997，37(2)：95～100．
31 Gyure; Dale C.Riboflavin Comopsition and Method for Productions. U.S.Pat.No.5, 034, 389.
32 Peter Nielsen, Gerhand et al[J]. Biosynthesis of Riboflavin[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1986,261(8):3661～3669.
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35 Gerhard Neuuberger, Adelbert Bacher. Biosythesis of Riboflavin. Biosynthesis of Riboflavin[J]. Biochemical and Biophysical Reserch Communications, 1985,127(1):175～181.
36 Gerhard Neuberger, Adelbert Bacher. Biosynthesis of Riboflavin[J]. Biochemical and Biophysical Reserch Communications 1986,139(3):1111～1116.
36 田中信男．抗菌素的作用机制-抗菌和抗癌作用的分子生物学[M]．北京：科学出版社，1977．
37 L.Y.巴布亚克．酵母中核黄素的过量生产．CN.Pat.No.1232872A.
38 张星元，王琴．阿舒假囊酵母过量合成核黄素性能的改良[J]．无锡轻工大学学报，1997，16(3)：14～19．
39 黄伟坤．食品检验与分析[M]．北京：中国轻工业出版社，1993：85～86．
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44 G.Andreu, M.D.Benaiges. A Simple Method for RNA Extraction from Yeasts. [J]Biotechnology and Bioengineening, 1988,(32):927～929.
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48 石磊．试验设计基础[M]．重庆：重庆大学出版社，1997：104～120．
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50 胡良平．实用统计分析教程[M]．北京：军事医学出版社，2001：541～550．
51 Douglas C.Matgomery (美) 汪仁官 陈荣昭译．实验设计与分析[M]．北京：中国统计出版社，1998：298～640．
52 欧竑宇，贾士儒．SAS软件在微生物培养条件优化中的应用[J]．天津轻工业学报，2001(1)：14～17．
53 惠大丰，姜长鉴．统计分析系统SAS软件实用教程[M]．北京航空航天大学出版社，1996．
54 董大钧．SAS统计分析[M]．大连：辽宁科学出版社，1996．
55 Foster, Edward W.Riboflabin Producing Strains of Microorganisms. U.S.Pat.No.5, 120, 655.
56 李嵘．发酵法生产核黄素[J]．无锡轻工大学学报，1997，16(1)：14～18．
57 张星元，王琴．代谢调节理论指导下的核黄素发酵条件[J]．无锡轻工大学学报，1997，16(4)：1～6．
58 史媛英．高活性干酸奶发酵剂的研究．天津轻工业学院硕士学位论文，1998．
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