连黛片对大肠癌端粒酶活性及hTERT mRNA表达的影响
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摘要
大肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于肺癌和乳腺癌，居第三，病因不明，预后较差，5年存活率不超过40％。在我国，随着人们生活水平的提高，膳食结构的变化，发病率有逐年上升趋势。近几年来，端粒酶在细胞衰老和癌变过程中的作用日益受到人们的重视，现代研究者普遍认为：端粒酶的激活是肿瘤形成过程中的关键步骤。
本项目以连黛片(左金丸加青黛)为受试药，研究中药复方在对端粒酶活性、相关基因表达的影响，从分子生物学的角度寻找中药抑癌可能的新途径，这对进一步探讨中药抑癌作用机理有重要意义，为今后从更深层次研究中药抑癌奠定一定的基础，也为开发新药提供了依据。
1、临床试验研究
目的：观察连黛片对非根治性术后或化疗后复发的大肠癌患者的临床疗效及对端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达的影响。
研究对象：35例大肠癌患者均来自广州中医药大学一附院2005．08—2006．08年间门诊及住院手术患者，经肠镜检查均为非根治性术后或化疗后复发患者。其中20例伴大肠腺瘤性息肉。
研究方法：(1)采用TRAP—ELISA法检测肿瘤组织端粒酶相对活性，荧光定量PCR法检测肿瘤组织端粒酶hTERTmRNA的表达。观察35例大肠癌患者肿瘤组织端粒酶相对活性及端粒酶hTERTmRNA的表达。同时比较其与癌旁组织、正常组织、腺瘤性息肉端粒酶相对活性及端粒酶hTERTmRNA的表达的差异。
(2)35例大肠癌患者按照单盲随机数字表法分为治疗组20例和对照组15例。治疗组20例大肠癌患者在不改变对症支持等常规用药基础上加服连黛片中药汤剂每次50ml(含黄连6g、吴茱萸1g、青黛3g)，每日两次。对照组15例大肠癌除不服连黛片外，其他与治疗组完全相同。疗程1个月，期间不使用与连黛片相类似的其它药物。分别观察两组患者主要临床症状积分的变化、中医症候疗效比较；两组患者肿瘤组织局部端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达量的变化。
结果：(1)大肠癌组织中端粒酶活性增强及端粒酶hTERTmRNA的高表达。端粒酶活性及端粒酶hTERTmRNA的表达在正常组织、癌旁组织、腺瘤性息肉、大肠癌组织呈递增趋势。其与年龄、性别、大肠癌病变部位及病理类型无关，随肿瘤组织学分级及临床分期的增加而呈上升趋势。
(2)疗程结束后，治疗组患者症状体征较对照组有改善。连黛片组在大便干或烂、腹胀或腹痛、呕吐或恶心、烦热口渴等症状优于对照组，在改善食欲、神疲乏力、口干口苦、纳呆等症状与对照组相当。在中医证候疗效方面，20例治疗组中显效为4例，有效为11例，无效为5例；15例对照组的显效为为1例，有效为4例，无效为10例。疗程结束后，肿瘤组织局部端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达量较对照组明显下降。在热毒内结和湿热下注二个证型的患者中，以热毒内结型中医证候疗效改善明显，肿瘤组织局部端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达量下降最为明显。
结论：连黛片能减轻患者临床症状体征，尤其对辩证为热毒聚于大肠的患者的症状改善尤为明显。可能的机制之一是通过改变与肿瘤密切相关的端粒酶活性及hTERTmRNA表达量。
2、动物试验研究
目的：观察连黛片对实验性HT29大肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达的影响。
研究方法：采用皮下注射HT29大肠癌细胞株制作结肠癌裸鼠模型，将皮下移植的裸小鼠随机分为3组。每组均在初次接种后7天进行灌胃治疗，连续灌胃一月。中药治疗组用连黛片灌胃治疗(每只灌胃2g／kg)，西药治疗组用端粒酶抑制剂3’—叠氮3’—脱氧胸腺核苷(叠氮胸苷，AZT，150mg／kg)灌胃治疗，空白对照组予以生理盐水灌胃。动态观察各组裸鼠肿瘤体积变化，用游标卡尺测量每组裸鼠移植瘤的大小。采用TRAP-ELISA方法检测肿瘤组织端粒酶活性变化，荧光定量PCR检测肿瘤组织端粒酶hTERTmRNA的表达，结果进行统计学分析。
结果：(1)初次接种后7天各组裸鼠皮下肿瘤大小比较无显著性差异，并用于下一步的试验。(2)一个月后治疗组裸鼠皮下肿瘤体积比较无明显差异，两组治疗组裸鼠皮下肿瘤块大小与空白组比较有差异；(3)空白对照组端粒酶相对活性较两组治疗组明显增强；空白对照组端粒酶hTERTmRNA的表达增多。中药组与AZT组端粒酶活性及端粒酶hTERTmRNA的表达改变无显著性差异。
结论：连黛片能抑制人大肠癌HT29裸小鼠移植瘤的增值，其机制之一可能是减少hTERTmRNA的表达，从而降低肿瘤组织端粒酶的活性。提示中医药防治疗大肠癌具有一定优势，深入开展以端粒酶为靶点的中医药治疗研究必将为防治大肠癌或其癌前病变开辟新的途径。
The large colon cancer is one of the most common malignant tumors inthe world. Its outbreak rate reside thirdly only next to lung cancer andthe mammary glands cancer. The cause of the disease isn't clear andprognosis is worse. Five years livability is not more than 40%. In ourcountry, with the elevation of life level and the change of meal structure,the outbreak rate is up-trend year by year. In the last few years, thefunction of telomerase in cell ageing and canceration is valued by peopleincreasingly. Modern researcher regard commonly:The activation oftelomerase is the key step in the tumor formation process.
This article takes Liandai recipe as the subjected to study theinfluence of Chinese herbal medicine compound prescribe to telomeraseand the expression of related gene.TO find a new path of the Chinese herbalmedicine suppression the cancer from the angle of the molecular biology,which has an important meaning to the mechanism of Chinese herbalmedicine suppression further cancer. This can establish a certainfoundation in order to study Chinese herbal medicine suppression to cancerfrom a deeper layer and provide a basis for the development new medicine.
1、The clinical trial study
Purpose:To Observe the clinical curative effect of Liandai recipe to thelarge colon cancer who had chemotherapy after not radical surgery and theinfluence of Liandai recipe to telomerase and the expression of relatedgene hTERTmRNA.
Research object
Method:(1) 35 patients were come from the First affiliated hospital ofthe GuangZhou university of Traditional Chinese Medicine from August of2005 to August of 2006. They were hospital patients after a surgicaloperation or were outpatients.
Study method:
(1) To observe telomerase activity and the expression of hTERTmRNA intumor local organization of 35 large colon cancer. In the meantime, tocompare the difference of telomerase activity and the expression ofhTERTmRNA between cancer side organization and the normal organization.
(2) Treating group of 20 patients take Liandai recipe decoction 50mls(which contained coptis chinensis 6g, Fructus Evodiaelg, IndigoNaturalis lg) twice a day extraly without changing Supportive treatment. Comparing group had the same Supportive treatment without takingLiandai recipe decoction. The course of treatment is one month, the twogroup had not take other drugs which had siminar function as Liandai recipedecoction.
Result:
(1)Confirming the higher telomerase activity and the expression of hTERTmRNAin tumor local organization of large colon cancer. The telomerase activityand the expression of hTERTmRNA are up-trend among normal colonorganization、side tumour organization、Adenomatous polypi and the largecolon cancer organization. They have no relativity with age、sex、diseasedregion in the large colon cancer and pathologic type, but they have aup-trend with anatomy grading and clinical stage.
(2)After treatment, symptoms and signs of treating group were easedcomparing with control group. The telomerase activity and the expressionof hTERTmRNA of treating group in tumor local organization of large coloncancer were lower than control group.
Conclusion:
Liandai recipe can ease the symptoms and signs of colon cancer patients.One of the possible mechanisms is to change telomerase activity and theexpression of hTERTmRNA which have close relativity with tumors.
2、The animal research study
Purpose: To observe the influence of Liandai recipe to the telomeraseactivity and the expression of hTERTmRNA in local tumour organizationof experiental naked mouse.
Method: To replicate the model of colon cancer of naked mouse which wereinjected HT29 colon cancer cell subcutaneously. Each naked mouse waslavaged after the first injection for one month. Chinese herbs treatinggroup was lavage with Liandai recipe(2g/kg); western drugs treating groupwas lavage with AZT(150mg/kg), blank control group was lavaged with 0.09%Sodium Chloride. To dynamicly observe the change of tumor volume of nakedmouse. To detect telomerase activity with TRAP—ELISA and the expressionof hTERTmRNA with fluorescent quantitation PCR. TO analysis the resultswith statistics method.
Result:
(1)There was no significant difference between the three groups abouttumor volume of naked mouse subcutaneously after seven days after thefirst innoculation.They were for next expreriment.
(2)There was no significant difference between treating group abouttumor volume of naked mouse subcutaneously after one month;There isdifference between treating group and control group about tumorvolume of naked mouse subcutaneously.
(3)There was no significant difference between treating groups about thechange of telomerase activity and the expression of hTERTmRNA;but there was significant difference between treating groups andcontrol group about the change of telomerase activity and theexpression of hTERTmRNA
Conclusion: Liandai recipe can restrain the increase of transplantationtumor of naked mouse of HT29 cell strain of colon tumour. One of thepossible mechanisms is to reduce thethe expression of hTERTmRNA and lower the telomerase activity in localtumor organization.
本项目以连黛片(左金丸加青黛)为受试药，研究中药复方在对端粒酶活性、相关基因表达的影响，从分子生物学的角度寻找中药抑癌可能的新途径，这对进一步探讨中药抑癌作用机理有重要意义，为今后从更深层次研究中药抑癌奠定一定的基础，也为开发新药提供了依据。
1、临床试验研究
目的：观察连黛片对非根治性术后或化疗后复发的大肠癌患者的临床疗效及对端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达的影响。
研究对象：35例大肠癌患者均来自广州中医药大学一附院2005．08—2006．08年间门诊及住院手术患者，经肠镜检查均为非根治性术后或化疗后复发患者。其中20例伴大肠腺瘤性息肉。
研究方法：(1)采用TRAP—ELISA法检测肿瘤组织端粒酶相对活性，荧光定量PCR法检测肿瘤组织端粒酶hTERTmRNA的表达。观察35例大肠癌患者肿瘤组织端粒酶相对活性及端粒酶hTERTmRNA的表达。同时比较其与癌旁组织、正常组织、腺瘤性息肉端粒酶相对活性及端粒酶hTERTmRNA的表达的差异。
(2)35例大肠癌患者按照单盲随机数字表法分为治疗组20例和对照组15例。治疗组20例大肠癌患者在不改变对症支持等常规用药基础上加服连黛片中药汤剂每次50ml(含黄连6g、吴茱萸1g、青黛3g)，每日两次。对照组15例大肠癌除不服连黛片外，其他与治疗组完全相同。疗程1个月，期间不使用与连黛片相类似的其它药物。分别观察两组患者主要临床症状积分的变化、中医症候疗效比较；两组患者肿瘤组织局部端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达量的变化。
结果：(1)大肠癌组织中端粒酶活性增强及端粒酶hTERTmRNA的高表达。端粒酶活性及端粒酶hTERTmRNA的表达在正常组织、癌旁组织、腺瘤性息肉、大肠癌组织呈递增趋势。其与年龄、性别、大肠癌病变部位及病理类型无关，随肿瘤组织学分级及临床分期的增加而呈上升趋势。
(2)疗程结束后，治疗组患者症状体征较对照组有改善。连黛片组在大便干或烂、腹胀或腹痛、呕吐或恶心、烦热口渴等症状优于对照组，在改善食欲、神疲乏力、口干口苦、纳呆等症状与对照组相当。在中医证候疗效方面，20例治疗组中显效为4例，有效为11例，无效为5例；15例对照组的显效为为1例，有效为4例，无效为10例。疗程结束后，肿瘤组织局部端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达量较对照组明显下降。在热毒内结和湿热下注二个证型的患者中，以热毒内结型中医证候疗效改善明显，肿瘤组织局部端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达量下降最为明显。
结论：连黛片能减轻患者临床症状体征，尤其对辩证为热毒聚于大肠的患者的症状改善尤为明显。可能的机制之一是通过改变与肿瘤密切相关的端粒酶活性及hTERTmRNA表达量。
2、动物试验研究
目的：观察连黛片对实验性HT29大肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其相关基因hTERTmRNA表达的影响。
研究方法：采用皮下注射HT29大肠癌细胞株制作结肠癌裸鼠模型，将皮下移植的裸小鼠随机分为3组。每组均在初次接种后7天进行灌胃治疗，连续灌胃一月。中药治疗组用连黛片灌胃治疗(每只灌胃2g／kg)，西药治疗组用端粒酶抑制剂3’—叠氮3’—脱氧胸腺核苷(叠氮胸苷，AZT，150mg／kg)灌胃治疗，空白对照组予以生理盐水灌胃。动态观察各组裸鼠肿瘤体积变化，用游标卡尺测量每组裸鼠移植瘤的大小。采用TRAP-ELISA方法检测肿瘤组织端粒酶活性变化，荧光定量PCR检测肿瘤组织端粒酶hTERTmRNA的表达，结果进行统计学分析。
结果：(1)初次接种后7天各组裸鼠皮下肿瘤大小比较无显著性差异，并用于下一步的试验。(2)一个月后治疗组裸鼠皮下肿瘤体积比较无明显差异，两组治疗组裸鼠皮下肿瘤块大小与空白组比较有差异；(3)空白对照组端粒酶相对活性较两组治疗组明显增强；空白对照组端粒酶hTERTmRNA的表达增多。中药组与AZT组端粒酶活性及端粒酶hTERTmRNA的表达改变无显著性差异。
结论：连黛片能抑制人大肠癌HT29裸小鼠移植瘤的增值，其机制之一可能是减少hTERTmRNA的表达，从而降低肿瘤组织端粒酶的活性。提示中医药防治疗大肠癌具有一定优势，深入开展以端粒酶为靶点的中医药治疗研究必将为防治大肠癌或其癌前病变开辟新的途径。
The large colon cancer is one of the most common malignant tumors inthe world. Its outbreak rate reside thirdly only next to lung cancer andthe mammary glands cancer. The cause of the disease isn't clear andprognosis is worse. Five years livability is not more than 40%. In ourcountry, with the elevation of life level and the change of meal structure,the outbreak rate is up-trend year by year. In the last few years, thefunction of telomerase in cell ageing and canceration is valued by peopleincreasingly. Modern researcher regard commonly:The activation oftelomerase is the key step in the tumor formation process.
This article takes Liandai recipe as the subjected to study theinfluence of Chinese herbal medicine compound prescribe to telomeraseand the expression of related gene.TO find a new path of the Chinese herbalmedicine suppression the cancer from the angle of the molecular biology,which has an important meaning to the mechanism of Chinese herbalmedicine suppression further cancer. This can establish a certainfoundation in order to study Chinese herbal medicine suppression to cancerfrom a deeper layer and provide a basis for the development new medicine.
1、The clinical trial study
Purpose:To Observe the clinical curative effect of Liandai recipe to thelarge colon cancer who had chemotherapy after not radical surgery and theinfluence of Liandai recipe to telomerase and the expression of relatedgene hTERTmRNA.
Research object
Method:(1) 35 patients were come from the First affiliated hospital ofthe GuangZhou university of Traditional Chinese Medicine from August of2005 to August of 2006. They were hospital patients after a surgicaloperation or were outpatients.
Study method:
(1) To observe telomerase activity and the expression of hTERTmRNA intumor local organization of 35 large colon cancer. In the meantime, tocompare the difference of telomerase activity and the expression ofhTERTmRNA between cancer side organization and the normal organization.
(2) Treating group of 20 patients take Liandai recipe decoction 50mls(which contained coptis chinensis 6g, Fructus Evodiaelg, IndigoNaturalis lg) twice a day extraly without changing Supportive treatment. Comparing group had the same Supportive treatment without takingLiandai recipe decoction. The course of treatment is one month, the twogroup had not take other drugs which had siminar function as Liandai recipedecoction.
Result:
(1)Confirming the higher telomerase activity and the expression of hTERTmRNAin tumor local organization of large colon cancer. The telomerase activityand the expression of hTERTmRNA are up-trend among normal colonorganization、side tumour organization、Adenomatous polypi and the largecolon cancer organization. They have no relativity with age、sex、diseasedregion in the large colon cancer and pathologic type, but they have aup-trend with anatomy grading and clinical stage.
(2)After treatment, symptoms and signs of treating group were easedcomparing with control group. The telomerase activity and the expressionof hTERTmRNA of treating group in tumor local organization of large coloncancer were lower than control group.
Conclusion:
Liandai recipe can ease the symptoms and signs of colon cancer patients.One of the possible mechanisms is to change telomerase activity and theexpression of hTERTmRNA which have close relativity with tumors.
2、The animal research study
Purpose: To observe the influence of Liandai recipe to the telomeraseactivity and the expression of hTERTmRNA in local tumour organizationof experiental naked mouse.
Method: To replicate the model of colon cancer of naked mouse which wereinjected HT29 colon cancer cell subcutaneously. Each naked mouse waslavaged after the first injection for one month. Chinese herbs treatinggroup was lavage with Liandai recipe(2g/kg); western drugs treating groupwas lavage with AZT(150mg/kg), blank control group was lavaged with 0.09%Sodium Chloride. To dynamicly observe the change of tumor volume of nakedmouse. To detect telomerase activity with TRAP—ELISA and the expressionof hTERTmRNA with fluorescent quantitation PCR. TO analysis the resultswith statistics method.
Result:
(1)There was no significant difference between the three groups abouttumor volume of naked mouse subcutaneously after seven days after thefirst innoculation.They were for next expreriment.
(2)There was no significant difference between treating group abouttumor volume of naked mouse subcutaneously after one month;There isdifference between treating group and control group about tumorvolume of naked mouse subcutaneously.
(3)There was no significant difference between treating groups about thechange of telomerase activity and the expression of hTERTmRNA;but there was significant difference between treating groups andcontrol group about the change of telomerase activity and theexpression of hTERTmRNA
Conclusion: Liandai recipe can restrain the increase of transplantationtumor of naked mouse of HT29 cell strain of colon tumour. One of thepossible mechanisms is to reduce thethe expression of hTERTmRNA and lower the telomerase activity in localtumor organization.
引文
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