大黄（庶虫）虫丸对小鼠免疫调节作用及其机理的实验研究
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摘要
目的：大黄(庶虫)虫丸具有活血化瘀、缓中补虚的功效，用于治疗形体赢瘦、腹满不食、肌肤甲错、两目黯黑的五劳虚极，内有干血之证。在临床上广泛用于治疗肝病、恶性肿瘤、慢性肾病、干燥综合征、关节病、皮肤病、乳腺增生病、子宫内膜异位症等与免疫失调相关的多种疾病，该方在抗凝、溶栓，改善血液流变学，保肝、护肝、抗肝纤维化，减轻肾组织病变，抑制肾组织纤维增生等方面的药理作用已得到深入研究，本课题旨在采用现代免疫学技术，结合分子生物学知识，系统地探讨大黄(庶虫)虫丸的免疫调节及其作用机理。为临床合理用药提供理论依据，并通过本方研究为活血化瘀法作用实质提供新的研究思路和方法。
方法：通过观察大黄(庶虫)虫丸对免疫功能正常及异常小鼠的免疫器官和免疫分子的影响，揭示大黄(庶虫)虫丸的免疫作用机制。具体分为：①大黄(庶虫)虫丸对正常和免疫抑制小鼠胸腺、脾脏结构及重量指数的影响：运用光镜和电镜观察免疫器官组织结构的变化，并检测免疫器官重量指数的变化。②大黄(庶虫)虫丸对正常和免疫抑制小鼠外周血及脾细胞悬液中T淋巴细胞亚群CD4~+CD25~+T细胞的影响。运用流式细胞术检测CD4~+CD25~+T细胞的百分率。⑨大黄(庶虫)虫丸对小鼠外周血、脾细胞IL-4、IFN-γ浓度的影响：运用环磷酰胺和OVA腹腔注射分别造成免疫抑制和免疫超常小鼠，采用ELISA法分别检测免疫正常、免疫抑制小鼠外周血和免疫超常小鼠脾脏分离的T淋巴细胞培养液中IL-4、IFN-γ的蛋白含量。④运用原位杂交方法检测小鼠不同免疫状态下的脾脏、胸腺组织及脾淋巴细胞的IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达情况。
结果：
①大黄(庶虫)虫丸对正常和免疫抑制小鼠胸腺、脾脏结构及重量指数的影响：正常组的脾脏与胸腺组织结构清晰、正常，免疫抑制组的脾脏与胸腺结构明显差异，结构分界不清，免疫细胞减少，淋巴细胞溶解，染色质变浅。服用大黄(庶虫)虫丸后，各组免疫器官形态结构不同程度得到改善，说明该方能够影响免疫器官。而对正常小鼠脾脏、胸腺重量指数无显著影响(P＞0.05)；可提高免疫抑制小鼠脾重量指数，中药大剂量可以提高胸腺重量指数。
②大黄(庶虫)虫丸对正常和免疫抑制小鼠外周血及脾细胞悬液中T淋巴细胞亚群CD4~+CD25~+T细胞的影响：结果表明，大黄(庶虫)虫丸对正常免疫小鼠调节性T细胞亚群没有明显提高或降低作用，可显著降低免疫抑制小鼠调节性T细胞亚群CD4~+CD25~+T细胞百分率(P＜0.01或P＜0.05)。
③大黄(庶虫)虫丸对小鼠外周血、脾淋巴细胞IL-4、IFN-γ浓度的影响：ELISA结果表明：对正常小鼠外周血的IFN-γ、IL-4含量没有明显影响(P＞0.05)；免疫抑制组小鼠外周血中IFN-γ、IL-4含量降低，与正常对照组比较，有显著性差异。通过不同剂量的大黄(庶虫)虫丸治疗后，IFN-γ浓度得到提高，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，而IL-4与抑制模型组比较，没有显著性差异(P＞0.05)。对免疫超常小鼠的检测表明，大黄(庶虫)虫丸能够提高免疫小鼠脾细胞中IFN-γ的蛋白含量，降低IL-4的蛋白含量。
＠大黄庚虫丸对小鼠脾脏、胸腺组织及脾细胞IL一mRNA、IFN1mKNA表达的
影响：结果显示，大黄赝虫丸对正常小鼠脾脏、胸腺组织中IFN十、IL叶YRNA
的表达没有明显影响。对免疫抑制小鼠脾脏、胸腺组织中IFN1YKNA的表达增强，
与免疫模型比较有显著性差异（P＜0刀5），但对1＊＊m NNA的表达没有明显影响。大
黄庚虫丸对免疫超常模型作用结果显示，该方可抑制＊AmKNA的表达，降低IL＊的
合成，同时可增强Hp4YInRNA的表达。
结论：从形态结构、免疫细胞、免疫分子等不同层次对大黄赝虫丸的免疫调节作
用进行了实验研究，结果显示，大黄庚虫丸对正常小鼠免疫器官形态学无明显影响，
但可改善免疫抑制小鼠免疫器官的形态结构，使之接近正常。对正常小鼠胸腺及脾脏
重量指数无明显影响。可提高免疫抑制模型小鼠免疫功能的作用，能够减少免疫抑制
小鼠脾细胞及外周血中CD4“CD25”细胞比例，提高外周血中IFN－Y的含量，增强细
胞免疫，对L＊的含量没有明显影响；对免疫超常型小鼠的免疫状态具有抑制作用，
该抑制作用主要是通过增强 IFN1mANA、抑制 ILAlRNA的合成，调整 TH／TllZ比
值，使 TH细胞占优势实现的。结果表明大黄赝虫丸的免疫调节作用，是通过双向调
节和多环节、多途径实现的。
Objective: Dahuangzhechongwan(DHZCW) has effects of promoting blood circulation to remove blood stasis, invigorating deficiency gradually, treating the deficiency of emaciated abdominal stuffiness, skin dry and no nourishment, darkish for eyes, and drying blood in body. In clinic, DHZCW were widely used to treat diseases correlation with immunization disorder, such as that of the liver, malignancy, chronic malignancy, dryness syndrome, arthropathy, skin disease, hyperplasia of mammary glands, endometriosis et al. The pharmacology of this prescription have been widely researched, such as resisting clotting, haemalysis, thrombolytic, improving hemorheology, protecting liver, resisting liver from fibrosis, bating nephrosis and inhibiting the fiber proliferation of kidney. So the purpose of this research is to study the immune regulation mechanism of DHZCW with modern immune technology and molecular biology knowledge. This research can reveal the pharmacology of DHZCW and provide theoretical base for reasonable
medication in clinical. By the study, new thoughts and methods for the research on the essential of blood-activating and stasis-γemoving prescriptions can be provided.
Methods: In order to reveal the immunological mechanism of DHZCW, The effect of DHZCW on the immune organ and molecule of normal mice and immune dysfunctional mice were studied. Just as following : (1)To study the effect of DHZCW on ponderance index and structure of thymus and spleen of normal and immune dysfunctional mice by detecting the structure of immune organ by optical microscope and electronical microscope, (2)the effect of DHZCW on double-positive CD4+CD25+T lymphocyte subpopulation in the peripheral blood and the cell suspension by flow cytometry. (3)To study the effect of DHZCW on the concentration of IL-4, IFN-γ in peripheral blood and spleen cell culture supernant in each group mice by ELISA.(4)To study the expression of IL-4mRNA,IFN-γ mRNA in thymus and spleen tissue and spleen cells of each group mice were detected by the hybrindization in situ respectively.
Results: (1)The effect of DHZCW on the ponderance index and the structure of thymus and spleen of normal mice and immune dysfunctional mice: Obviously shrink and regression in the thymus and the spleen appear in the immunospression mice groups. The structure were blur and the cells in immune organ decreased and diffluenced, chromat becomed fade. Given different dosages DHZCW differently lessen the variety of these mice. The indicate that DHZCW affected the immune organs. And the thymus and the spleen of ponderance index showed no effection in each group.
(2)the effect of DHZCW on the subtype of T lymphocyte cell in the peripheral blood and the cell suspension: the rate of CD4+CD25+T cell in the peripheral blood and the cell suspension of the immunsuppression group was higher than the normal group, DHZCW had no effect on the mice in the normal group, but had reduced on the mice in the
immunosuppression group.
(3) The concentration of IL-4,IFN-γ in peripheral blood and spleen cell culture supernant by ELISA appeared: no difference in normal groups. IFN-γ apparently decreased, while IL-4 apparently increased in hyperimmunity model groups. After DHZCW, the effects of IFN- Y apparently increased markedly, while IL-4 decreased. Both IFN- Y and IL-4 apparently decreased compare to the normal mice in immunsuppression groups, there was obvious difference reduced in IFN- Y contents and no difference in IL-4 after treatments.
(4)The results of in situ hybrindization showed: no difference in normal group, and increased expression of IFN- Y mRNA no difference in IL-4mRNA of immune organs in immunsuppression mice. For the hyperimmunity, DHZCW can enhance the expression of IFN-γ mRNA and reduce IL-4mRNA.
Conclusion: The study did experiment research on the immunomodulation of DHZCW from the aspect of formal structure, immuological cell, and protein. DHZCW can improve the stucture of immune organ, it has the immune function of adjustion . The regulation was carri
方法：通过观察大黄(庶虫)虫丸对免疫功能正常及异常小鼠的免疫器官和免疫分子的影响，揭示大黄(庶虫)虫丸的免疫作用机制。具体分为：①大黄(庶虫)虫丸对正常和免疫抑制小鼠胸腺、脾脏结构及重量指数的影响：运用光镜和电镜观察免疫器官组织结构的变化，并检测免疫器官重量指数的变化。②大黄(庶虫)虫丸对正常和免疫抑制小鼠外周血及脾细胞悬液中T淋巴细胞亚群CD4~+CD25~+T细胞的影响。运用流式细胞术检测CD4~+CD25~+T细胞的百分率。⑨大黄(庶虫)虫丸对小鼠外周血、脾细胞IL-4、IFN-γ浓度的影响：运用环磷酰胺和OVA腹腔注射分别造成免疫抑制和免疫超常小鼠，采用ELISA法分别检测免疫正常、免疫抑制小鼠外周血和免疫超常小鼠脾脏分离的T淋巴细胞培养液中IL-4、IFN-γ的蛋白含量。④运用原位杂交方法检测小鼠不同免疫状态下的脾脏、胸腺组织及脾淋巴细胞的IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达情况。
结果：
①大黄(庶虫)虫丸对正常和免疫抑制小鼠胸腺、脾脏结构及重量指数的影响：正常组的脾脏与胸腺组织结构清晰、正常，免疫抑制组的脾脏与胸腺结构明显差异，结构分界不清，免疫细胞减少，淋巴细胞溶解，染色质变浅。服用大黄(庶虫)虫丸后，各组免疫器官形态结构不同程度得到改善，说明该方能够影响免疫器官。而对正常小鼠脾脏、胸腺重量指数无显著影响(P＞0.05)；可提高免疫抑制小鼠脾重量指数，中药大剂量可以提高胸腺重量指数。
②大黄(庶虫)虫丸对正常和免疫抑制小鼠外周血及脾细胞悬液中T淋巴细胞亚群CD4~+CD25~+T细胞的影响：结果表明，大黄(庶虫)虫丸对正常免疫小鼠调节性T细胞亚群没有明显提高或降低作用，可显著降低免疫抑制小鼠调节性T细胞亚群CD4~+CD25~+T细胞百分率(P＜0.01或P＜0.05)。
③大黄(庶虫)虫丸对小鼠外周血、脾淋巴细胞IL-4、IFN-γ浓度的影响：ELISA结果表明：对正常小鼠外周血的IFN-γ、IL-4含量没有明显影响(P＞0.05)；免疫抑制组小鼠外周血中IFN-γ、IL-4含量降低，与正常对照组比较，有显著性差异。通过不同剂量的大黄(庶虫)虫丸治疗后，IFN-γ浓度得到提高，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，而IL-4与抑制模型组比较，没有显著性差异(P＞0.05)。对免疫超常小鼠的检测表明，大黄(庶虫)虫丸能够提高免疫小鼠脾细胞中IFN-γ的蛋白含量，降低IL-4的蛋白含量。
＠大黄庚虫丸对小鼠脾脏、胸腺组织及脾细胞IL一mRNA、IFN1mKNA表达的
影响：结果显示，大黄赝虫丸对正常小鼠脾脏、胸腺组织中IFN十、IL叶YRNA
的表达没有明显影响。对免疫抑制小鼠脾脏、胸腺组织中IFN1YKNA的表达增强，
与免疫模型比较有显著性差异（P＜0刀5），但对1＊＊m NNA的表达没有明显影响。大
黄庚虫丸对免疫超常模型作用结果显示，该方可抑制＊AmKNA的表达，降低IL＊的
合成，同时可增强Hp4YInRNA的表达。
结论：从形态结构、免疫细胞、免疫分子等不同层次对大黄赝虫丸的免疫调节作
用进行了实验研究，结果显示，大黄庚虫丸对正常小鼠免疫器官形态学无明显影响，
但可改善免疫抑制小鼠免疫器官的形态结构，使之接近正常。对正常小鼠胸腺及脾脏
重量指数无明显影响。可提高免疫抑制模型小鼠免疫功能的作用，能够减少免疫抑制
小鼠脾细胞及外周血中CD4“CD25”细胞比例，提高外周血中IFN－Y的含量，增强细
胞免疫，对L＊的含量没有明显影响；对免疫超常型小鼠的免疫状态具有抑制作用，
该抑制作用主要是通过增强 IFN1mANA、抑制 ILAlRNA的合成，调整 TH／TllZ比
值，使 TH细胞占优势实现的。结果表明大黄赝虫丸的免疫调节作用，是通过双向调
节和多环节、多途径实现的。
Objective: Dahuangzhechongwan(DHZCW) has effects of promoting blood circulation to remove blood stasis, invigorating deficiency gradually, treating the deficiency of emaciated abdominal stuffiness, skin dry and no nourishment, darkish for eyes, and drying blood in body. In clinic, DHZCW were widely used to treat diseases correlation with immunization disorder, such as that of the liver, malignancy, chronic malignancy, dryness syndrome, arthropathy, skin disease, hyperplasia of mammary glands, endometriosis et al. The pharmacology of this prescription have been widely researched, such as resisting clotting, haemalysis, thrombolytic, improving hemorheology, protecting liver, resisting liver from fibrosis, bating nephrosis and inhibiting the fiber proliferation of kidney. So the purpose of this research is to study the immune regulation mechanism of DHZCW with modern immune technology and molecular biology knowledge. This research can reveal the pharmacology of DHZCW and provide theoretical base for reasonable
medication in clinical. By the study, new thoughts and methods for the research on the essential of blood-activating and stasis-γemoving prescriptions can be provided.
Methods: In order to reveal the immunological mechanism of DHZCW, The effect of DHZCW on the immune organ and molecule of normal mice and immune dysfunctional mice were studied. Just as following : (1)To study the effect of DHZCW on ponderance index and structure of thymus and spleen of normal and immune dysfunctional mice by detecting the structure of immune organ by optical microscope and electronical microscope, (2)the effect of DHZCW on double-positive CD4+CD25+T lymphocyte subpopulation in the peripheral blood and the cell suspension by flow cytometry. (3)To study the effect of DHZCW on the concentration of IL-4, IFN-γ in peripheral blood and spleen cell culture supernant in each group mice by ELISA.(4)To study the expression of IL-4mRNA,IFN-γ mRNA in thymus and spleen tissue and spleen cells of each group mice were detected by the hybrindization in situ respectively.
Results: (1)The effect of DHZCW on the ponderance index and the structure of thymus and spleen of normal mice and immune dysfunctional mice: Obviously shrink and regression in the thymus and the spleen appear in the immunospression mice groups. The structure were blur and the cells in immune organ decreased and diffluenced, chromat becomed fade. Given different dosages DHZCW differently lessen the variety of these mice. The indicate that DHZCW affected the immune organs. And the thymus and the spleen of ponderance index showed no effection in each group.
(2)the effect of DHZCW on the subtype of T lymphocyte cell in the peripheral blood and the cell suspension: the rate of CD4+CD25+T cell in the peripheral blood and the cell suspension of the immunsuppression group was higher than the normal group, DHZCW had no effect on the mice in the normal group, but had reduced on the mice in the
immunosuppression group.
(3) The concentration of IL-4,IFN-γ in peripheral blood and spleen cell culture supernant by ELISA appeared: no difference in normal groups. IFN-γ apparently decreased, while IL-4 apparently increased in hyperimmunity model groups. After DHZCW, the effects of IFN- Y apparently increased markedly, while IL-4 decreased. Both IFN- Y and IL-4 apparently decreased compare to the normal mice in immunsuppression groups, there was obvious difference reduced in IFN- Y contents and no difference in IL-4 after treatments.
(4)The results of in situ hybrindization showed: no difference in normal group, and increased expression of IFN- Y mRNA no difference in IL-4mRNA of immune organs in immunsuppression mice. For the hyperimmunity, DHZCW can enhance the expression of IFN-γ mRNA and reduce IL-4mRNA.
Conclusion: The study did experiment research on the immunomodulation of DHZCW from the aspect of formal structure, immuological cell, and protein. DHZCW can improve the stucture of immune organ, it has the immune function of adjustion . The regulation was carri
引文
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