莲子心中黄酮类物质与生物碱的分离纯化工艺研究
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摘要
莲子心(Plumula Nelumubinis)为睡莲科莲属植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)成熟种子中的绿色幼叶及胚根,是一种常用药材。莲子心中含生物碱、黄酮、多糖及挥发油等多种活性物质,具有降压、抗心律失常、降血糖、逆转肿瘤多药耐药、抗氧化等药理活性,在临床治疗及预防保健方面具有广泛的应用价值。以往对莲子心的研究主要集中在生物碱类物质的提取分离纯化及药理活性,而对莲子心黄酮类物质的研究较少,未能将莲子心资源充分利用。更重要的是,对莲子心中生物碱的分离常使用有毒的有机溶剂,处理繁琐,对环境及人身危害较大,不适合大规模工业生产。为了充分利用莲子心资源,克服现有工艺的缺点,本课题建立了一种在纯化莲子心生物碱的同时,富集莲子心中黄酮类物质的方法,主要研究内容与所得结果如下：
1.ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂应用于莲子心提取液的除杂工艺研究
应用ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂处理莲子心提取液,以去除叶绿素、粘液质、蛋白质、鞣质等杂质。以Nef保留率及固形物去除率为指标,在单因素实验的基础上,运用正交实验设计,优化了工艺条件。在药液浓度为1：6,在80℃下先加入澄清剂B组分0.8 mL·g-1,搅拌10 min后保温30 min；再加入A组分0.4 mL·g-1,搅拌10 min后保温30 min的工艺条件下,固形物去除率为22.81%、甲基莲心碱含量保留率为89.42%。采用ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂对莲子心提取液进行预处理,可以起到较好的除杂效果。
2.壳聚糖对莲子心提取液的除杂工艺研究
采用壳聚糖作为澄清剂处理莲子心提取液,以固形物去除率、甲基莲心碱保留率为指标,在单因素分析的基础上采用正交实验设计及响应面法Box-Benhnken中心组合实验设计对比优化了除杂工艺条件。结果表明在莲子心提取液药液比为1：5或1：5.5,壳聚糖加入量为1.2 mL·g-,作用温度为60℃,pH值为6.2的工艺条件下,固形物去除率约为22%,Nef保留率约为90%。正交实验设计与响应面法优化的工艺条件差别不大。
3.离子交换树脂同步分离和富集莲子心中黄酮类物质与生物碱
采用静态吸附和动态吸附相结合的方法,筛选了几种不同性质的阳离子交换树脂,最终确立了4#大孔阳离子交换树脂分离和富集莲子心中黄酮类物质与生物碱的工艺：称取20.00g(约30mL)已处理好的树脂,纯化水湿法装柱(直径16mm,高150mm),分别吸取药液比为1：6的莲子心除杂液240mL(8BV)上柱,依次用5BV纯化水洗去杂质,10BV 70%乙醇洗脱黄酮类物质,7BV 0.02 g·mL-1NaC1-70%乙醇洗脱生物碱,流速为2BV·h-1。研究结果表明,纯化后黄酮和生物碱纯度大大提高,精制倍数可分别达27.08倍及9.48倍,洗脱率分别为84.28%及88.84%。表明该工艺较为稳定可靠,且分离富集效果显著。
4.莲子心中黄酮类物质的纯化与结构表征
利用聚酰胺柱层析对分离后的总黄酮进行分步梯度洗脱,得到20%、30%、40%、50%乙醇洗脱液组分。采用高效制备液相色谱对分离度较好的40%组分进一步分离,得到5个化合物。
Plumula Nelumubinis, the embryo of the seed of Nelumbo nucifera GAERTN., has been extensively used as a traditional medicinal herb in China for thousands of years. It has many pharmacological activities such as the alkaloids, the flavonoids, polysaccharides, volatile oil and so on, which was primarily used for nervous disorders, insomnia, high fevers with restlessness, reversing multidrug resistance and cardiovascular diseases such as hypertension and arrhythmia. The previous research were mainly focused on extraction, isolation, purification and pharmacology activity of alkaloids, the research on flavonoids were somehow ignored. More important, the organic solvent to separate the alkaloids are usually poisonous, and the procedures are cumbersome. To make full use of the medicinal and overcome the weakness of the existing technology, this project try to establish a new method to separate alkaloids, and to enrich the flavonoids at the same time. It is quick, simple, environment-friendly and with high utilization of medicine. The chief contents and results of this research are as follows:
1. Precipitation of Plumula Nelumubinis Extract with ZTC1+1-ⅡClarifiers
In this part, ZTC1+1-Ⅱnatural clarify agents was used to remove impurities such as chlorophyll, mucilage glue, proteins and tannins from Plumula Nelumubinis. On the basis of single-factor test, orthogonal design was carried out to optimize the precipitation process in which the solids removal rate and remaining rates of neferine as indexs. According to the results, the optimal process was condensing the extract solution to 1:6 (herb:herb solution), the adding order of 2 components of ZTC1+1-Ⅱnatural clarifier was to add component B firstly and then add component A, the dosages of ZTC1+1-Ⅱwere 0.8mL·g-1 for clarifier B and 0.4mL·-1 for clarifier A, the reaction temperature of clarifier was 80℃, then stirring 10min and holding in water bath at 80℃for 30min respectively. The solids removal rate was 22.81% and the remaining rates of neferine was 89.42%. We can draw a conclusion that ZTC 1+1-Ⅱnatural clarify agents can be used to effectively remove the impurities of extract of Plumula Nelumubinis.
2. Precipitation of Plumula Nelumubinis Extract with chitosan
Chitosan was used to purify the extract of Plumula Nelumubinis. Orthogonal design and response surface method were comparaed to optimize the precipitation process on the basis of single-factor test in which removal rate and remaining rates of neferine were chosen as indexs. According to the results, the best experimental conditions were as follow: the concentration of extract solution was 1:5 or 1:5.5 (herb:extract solution), the dosages of chitosan were 1.2mL·g-1, the reaction temperature of clarifier was 60℃and the pH value was 6.2. There is no significant differences between the results of optimization.
3. Separation and enrichment of alkaloids and flavonoids simultaneously by using ion-exchange resin
Static adsorption and dynamic adsorption were used to screen out the best resin in 4 different types of ion exchange resins,4# resin was finally chosen. Based on the reseach of initial solution volume, the velocity of initial solution and eluent, we optimize the technology of separation and enrichment conditions. With the optimized process, the purity of flavonoids and alkaloids were significantly enhanced to 27.08 and 9.48 times than ever respectively.
4. The purification of the flavonoids of Plumula Nelumubinis
The separated flavonoids were desorbed by gradient elution 20%, 30%,40%, and 50% ethanol in the polyamide column gradually. The flavonoids components of fraction of 40% ethanol eluent were further separated. Five fractions were collected after the flavonoids are further separated by Prep-HPLC.
1.ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂应用于莲子心提取液的除杂工艺研究
应用ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂处理莲子心提取液,以去除叶绿素、粘液质、蛋白质、鞣质等杂质。以Nef保留率及固形物去除率为指标,在单因素实验的基础上,运用正交实验设计,优化了工艺条件。在药液浓度为1：6,在80℃下先加入澄清剂B组分0.8 mL·g-1,搅拌10 min后保温30 min；再加入A组分0.4 mL·g-1,搅拌10 min后保温30 min的工艺条件下,固形物去除率为22.81%、甲基莲心碱含量保留率为89.42%。采用ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂对莲子心提取液进行预处理,可以起到较好的除杂效果。
2.壳聚糖对莲子心提取液的除杂工艺研究
采用壳聚糖作为澄清剂处理莲子心提取液,以固形物去除率、甲基莲心碱保留率为指标,在单因素分析的基础上采用正交实验设计及响应面法Box-Benhnken中心组合实验设计对比优化了除杂工艺条件。结果表明在莲子心提取液药液比为1：5或1：5.5,壳聚糖加入量为1.2 mL·g-,作用温度为60℃,pH值为6.2的工艺条件下,固形物去除率约为22%,Nef保留率约为90%。正交实验设计与响应面法优化的工艺条件差别不大。
3.离子交换树脂同步分离和富集莲子心中黄酮类物质与生物碱
采用静态吸附和动态吸附相结合的方法,筛选了几种不同性质的阳离子交换树脂,最终确立了4#大孔阳离子交换树脂分离和富集莲子心中黄酮类物质与生物碱的工艺：称取20.00g(约30mL)已处理好的树脂,纯化水湿法装柱(直径16mm,高150mm),分别吸取药液比为1：6的莲子心除杂液240mL(8BV)上柱,依次用5BV纯化水洗去杂质,10BV 70%乙醇洗脱黄酮类物质,7BV 0.02 g·mL-1NaC1-70%乙醇洗脱生物碱,流速为2BV·h-1。研究结果表明,纯化后黄酮和生物碱纯度大大提高,精制倍数可分别达27.08倍及9.48倍,洗脱率分别为84.28%及88.84%。表明该工艺较为稳定可靠,且分离富集效果显著。
4.莲子心中黄酮类物质的纯化与结构表征
利用聚酰胺柱层析对分离后的总黄酮进行分步梯度洗脱,得到20%、30%、40%、50%乙醇洗脱液组分。采用高效制备液相色谱对分离度较好的40%组分进一步分离,得到5个化合物。
Plumula Nelumubinis, the embryo of the seed of Nelumbo nucifera GAERTN., has been extensively used as a traditional medicinal herb in China for thousands of years. It has many pharmacological activities such as the alkaloids, the flavonoids, polysaccharides, volatile oil and so on, which was primarily used for nervous disorders, insomnia, high fevers with restlessness, reversing multidrug resistance and cardiovascular diseases such as hypertension and arrhythmia. The previous research were mainly focused on extraction, isolation, purification and pharmacology activity of alkaloids, the research on flavonoids were somehow ignored. More important, the organic solvent to separate the alkaloids are usually poisonous, and the procedures are cumbersome. To make full use of the medicinal and overcome the weakness of the existing technology, this project try to establish a new method to separate alkaloids, and to enrich the flavonoids at the same time. It is quick, simple, environment-friendly and with high utilization of medicine. The chief contents and results of this research are as follows:
1. Precipitation of Plumula Nelumubinis Extract with ZTC1+1-ⅡClarifiers
In this part, ZTC1+1-Ⅱnatural clarify agents was used to remove impurities such as chlorophyll, mucilage glue, proteins and tannins from Plumula Nelumubinis. On the basis of single-factor test, orthogonal design was carried out to optimize the precipitation process in which the solids removal rate and remaining rates of neferine as indexs. According to the results, the optimal process was condensing the extract solution to 1:6 (herb:herb solution), the adding order of 2 components of ZTC1+1-Ⅱnatural clarifier was to add component B firstly and then add component A, the dosages of ZTC1+1-Ⅱwere 0.8mL·g-1 for clarifier B and 0.4mL·-1 for clarifier A, the reaction temperature of clarifier was 80℃, then stirring 10min and holding in water bath at 80℃for 30min respectively. The solids removal rate was 22.81% and the remaining rates of neferine was 89.42%. We can draw a conclusion that ZTC 1+1-Ⅱnatural clarify agents can be used to effectively remove the impurities of extract of Plumula Nelumubinis.
2. Precipitation of Plumula Nelumubinis Extract with chitosan
Chitosan was used to purify the extract of Plumula Nelumubinis. Orthogonal design and response surface method were comparaed to optimize the precipitation process on the basis of single-factor test in which removal rate and remaining rates of neferine were chosen as indexs. According to the results, the best experimental conditions were as follow: the concentration of extract solution was 1:5 or 1:5.5 (herb:extract solution), the dosages of chitosan were 1.2mL·g-1, the reaction temperature of clarifier was 60℃and the pH value was 6.2. There is no significant differences between the results of optimization.
3. Separation and enrichment of alkaloids and flavonoids simultaneously by using ion-exchange resin
Static adsorption and dynamic adsorption were used to screen out the best resin in 4 different types of ion exchange resins,4# resin was finally chosen. Based on the reseach of initial solution volume, the velocity of initial solution and eluent, we optimize the technology of separation and enrichment conditions. With the optimized process, the purity of flavonoids and alkaloids were significantly enhanced to 27.08 and 9.48 times than ever respectively.
4. The purification of the flavonoids of Plumula Nelumubinis
The separated flavonoids were desorbed by gradient elution 20%, 30%,40%, and 50% ethanol in the polyamide column gradually. The flavonoids components of fraction of 40% ethanol eluent were further separated. Five fractions were collected after the flavonoids are further separated by Prep-HPLC.
引文
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