全蝎抗凝活性部位的分离分析及酶解动力学研究
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摘要
目的研究全蝎酶解工艺,分离纯化抗凝活性部位,探讨该酶解反应机理,求算动力学和热力学参数。
方法以APTT、纤维蛋白原平板溶解圈面积为指标,结合光密度法和蛋白质水解度优选胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解全蝎的工艺条件,确定酶解温度、时间和酶底比等工艺参数。采用凝胶过滤层析技术分离纯化胃蛋白酶酶解混合多肽并对其进行初步质量标准研究。基于米氏方程,考察全蝎酶解过程的动力学,在此基础上推算速率常数、活化能等动力学、热力学函数值。
结果1)全蝎最优酶解工艺为：全蝎细粉37℃人工胃液加入3.0%(酶底比)胃蛋白酶酶解3h,残渣转入37℃人工肠液继加入5%(酶底比)胰蛋白酶酶解4h。2)胃蛋白酶酶解物以去离子水洗脱,依次经葡聚糖凝胶Sephadex G-100、SephadexG-50或SephadexG-25层析,收集洗脱液以药效筛选得到抗凝活性部位QF50-3-③。3)绘制全蝎胃蛋白酶酶解体系不同条件下的水解曲线,推导该动力学方程(dH)/(dt)=αS 0e-bH=(19.525E0+1.2666S0)e-0.098h,并求得该体系相应的热力学和动力学常数Km=0.00363(g·L-1),Ea=34.6577(KJ·mol-1)。
结论本文确立了全蝎提取工艺路线,为动物药酶解法提取提供了研究模式；分离纯化全蝎抗凝活性部位,为全蝎抗凝药效研究奠定了物质基础；进行酶解过程的动力学和热力学研究,从而为全蝎酶解的工艺设计及条件考察提供了基础理论数据。
Objective:To study the enzymatic process of scorpion, separate and purify the anti-coagulate active components; explore the enzymatic hydrolysis reaction mechanism, calculate the thermodynamic and dynamics parameters.
Methods:Taken the area of fibrinogen plate assay lysis zone and activated partial throboplstin time (APTT) as the index, combined with optical density and hydrolysis degree of protein, optimum conditions of scorpion's enzymatic process with pepsin and trypsin to obtain parameters as hydrolysis temperature,time and ratio of enzyme-substrate. Gel filtration was used to separate and purify mixture of peptide from the pepsin enzymolysis of scorpion and do preliminary research on quality standard. Based on M-M equation, investigated the dynamics during the hydrolysis process, and figure out the thermodynamic and dynamics foundation such as rate constant and activation energy and etc.
Results:1) The best enzymatic process of scorpion was as follows:Scorpion power was firstly hydrolyzed for 3 hours in an artificial gastric liquid at 37℃which contained 3.0% pepsin (pepsin to substrate). Then the residue was hydrolyzed for 4 hours in artificial intestine liquid at the same temperature and contained 5.0% trypsin (trypsin to substrate).2) The hydrolysates were purified with gel filtration chromatography in Sephadex G-100, Sephadex G-50 or SephadexG-25 in proper order, eluted by deionized water, obtained the anti-coagulate active components QF50-3-③from the eluent by pharmacodynamic screening.3) Drawing the curve of hydrolysis in different conditions, deduced the dynamics dH/dt=aS 0e-bH= (19.525E0+1.2666S0) e-0.098h, and the reaction constants were determined as Km=0.00363(g·L-1), Ea=34.6577 KJ·mol-1,in accordance with the proposed kinetic model.
Conclusion:established the research route of extracting scorpion, which provides a kind of research mode for animal drugs enzyme-extracting; separate and purify the anti-coagulate active components which lays the foundation for scorpion's anticoagulation pharmacodynamical research; do research on thermodynamic and dynamics during the hydrolysis process, which provides basic theoretical data for process design and condition investigation of scorpion enzymatic process.
方法以APTT、纤维蛋白原平板溶解圈面积为指标,结合光密度法和蛋白质水解度优选胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解全蝎的工艺条件,确定酶解温度、时间和酶底比等工艺参数。采用凝胶过滤层析技术分离纯化胃蛋白酶酶解混合多肽并对其进行初步质量标准研究。基于米氏方程,考察全蝎酶解过程的动力学,在此基础上推算速率常数、活化能等动力学、热力学函数值。
结果1)全蝎最优酶解工艺为：全蝎细粉37℃人工胃液加入3.0%(酶底比)胃蛋白酶酶解3h,残渣转入37℃人工肠液继加入5%(酶底比)胰蛋白酶酶解4h。2)胃蛋白酶酶解物以去离子水洗脱,依次经葡聚糖凝胶Sephadex G-100、SephadexG-50或SephadexG-25层析,收集洗脱液以药效筛选得到抗凝活性部位QF50-3-③。3)绘制全蝎胃蛋白酶酶解体系不同条件下的水解曲线,推导该动力学方程(dH)/(dt)=αS 0e-bH=(19.525E0+1.2666S0)e-0.098h,并求得该体系相应的热力学和动力学常数Km=0.00363(g·L-1),Ea=34.6577(KJ·mol-1)。
结论本文确立了全蝎提取工艺路线,为动物药酶解法提取提供了研究模式；分离纯化全蝎抗凝活性部位,为全蝎抗凝药效研究奠定了物质基础；进行酶解过程的动力学和热力学研究,从而为全蝎酶解的工艺设计及条件考察提供了基础理论数据。
Objective:To study the enzymatic process of scorpion, separate and purify the anti-coagulate active components; explore the enzymatic hydrolysis reaction mechanism, calculate the thermodynamic and dynamics parameters.
Methods:Taken the area of fibrinogen plate assay lysis zone and activated partial throboplstin time (APTT) as the index, combined with optical density and hydrolysis degree of protein, optimum conditions of scorpion's enzymatic process with pepsin and trypsin to obtain parameters as hydrolysis temperature,time and ratio of enzyme-substrate. Gel filtration was used to separate and purify mixture of peptide from the pepsin enzymolysis of scorpion and do preliminary research on quality standard. Based on M-M equation, investigated the dynamics during the hydrolysis process, and figure out the thermodynamic and dynamics foundation such as rate constant and activation energy and etc.
Results:1) The best enzymatic process of scorpion was as follows:Scorpion power was firstly hydrolyzed for 3 hours in an artificial gastric liquid at 37℃which contained 3.0% pepsin (pepsin to substrate). Then the residue was hydrolyzed for 4 hours in artificial intestine liquid at the same temperature and contained 5.0% trypsin (trypsin to substrate).2) The hydrolysates were purified with gel filtration chromatography in Sephadex G-100, Sephadex G-50 or SephadexG-25 in proper order, eluted by deionized water, obtained the anti-coagulate active components QF50-3-③from the eluent by pharmacodynamic screening.3) Drawing the curve of hydrolysis in different conditions, deduced the dynamics dH/dt=aS 0e-bH= (19.525E0+1.2666S0) e-0.098h, and the reaction constants were determined as Km=0.00363(g·L-1), Ea=34.6577 KJ·mol-1,in accordance with the proposed kinetic model.
Conclusion:established the research route of extracting scorpion, which provides a kind of research mode for animal drugs enzyme-extracting; separate and purify the anti-coagulate active components which lays the foundation for scorpion's anticoagulation pharmacodynamical research; do research on thermodynamic and dynamics during the hydrolysis process, which provides basic theoretical data for process design and condition investigation of scorpion enzymatic process.
引文
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