抗猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)噬菌体抗体文库的构建及筛选
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摘要
背景:猪圆环病毒是迄今发现的最小的病毒之一,现已知它包括PCV1和PCV2两个血型,其中PCV2是致病性病毒,它与很多疾病的发生有关。猪圆环病毒现已成为世界范围内危害养猪业最大的病原体之一,因此PCV2的早期诊断对于PCV2的防控至关重要。目的:本研究利用噬菌体展示技术构建猪圆环病毒Ⅱ型噬菌体抗体文库并做了初步筛选研究。方法:将PCV2的ORF2区的基因表达的蛋白作为免疫原免疫小鼠,取血清效价较好的小鼠脾脏,提取总RNA,并反转录成cDNA,以cDNA为模板扩增抗体的VH和VL片段。利用重叠延伸PCR将VH与VL用(Gly4ser)3多肽连接起来构建成sc Fv片段,将噬菌粒载体PCANTAB-5e用sfiⅠ和NotⅠ酶切后与sc Fv构成重组载体,转入到大肠杆菌TG1中,菌液PCR、质粒PCR、酶切鉴定以及序列测序鉴定。随后用辅助噬菌体M13K07辅助感染构成噬菌体文库,利用不同浓度包被原的亲和力筛选方法,筛选出针对猪圆环病毒的噬菌体抗体。结果:SDS-PAGE、ELISA等鉴定结果显示:PCV2的ORF2融合蛋白26KD,三只小鼠效价均达到106,总RNA提取完整,目的条带VH和VL片段大约300bp到400bp之间显示正确,菌液PCR、重组质粒PCR以及酶切鉴定结果显示转化成功,每轮筛选都有富集现象,18号克隆鉴定为阳性。结论:抗猪圆环病毒Ⅱ型噬菌体文库构建成功,成功筛选出特异性的猪圆环病毒单链抗体克隆,为抗PCV2单链抗体的制备以及病毒的检测奠定了基础。
引文